• facebook
  • linkedin
  • youtube

Uzliesmojuma sākumposmā, ņemot vērā straujo attīstību, aizdomās turēto pacientu ātra diagnostika ir atslēga COVID-19 profilaksei.Dažiem apstiprinātiem nukleīnskābju noteikšanas reaģentiem ir īss izstrādes laiks, un pastāv tādas problēmas kā sasteigta veiktspējas apstiprināšana, nepietiekama reaģenta optimizācija un lielas atšķirības starp partijām;Dažādu klīnisko laboratoriju problēmas dažādos nukleīnskābju noteikšanas procesa aspektos var ietekmēt arī nukleīnskābju noteikšanas rezultātu precizitāti.Šajā rakstā galvenā uzmanība tiks pievērsta galvenajām saitēm un punktiem pašreizējā SARS-CoV-2 nukleīnskābju noteikšanā, kā arī analizētas kļūdas negatīvas un pozitīvas laboratorijas nukleīnskābju noteikšanas atkārtotas pārbaudes un klīniskās neatbilstības problēmas.

SARS-CoV-2 nukleīnskābju noteikšanas principi

SARS-CoV-2 ir RNS vīruss ar aptuveni 29 kb lielu genoma secību un 10 gēniem, kas var efektīvi kodēt 10 proteīnus.Vīrusi sastāv no RNS un olbaltumvielām, un ārējais slānis ir ārējais pārklājums, kas sastāv no lipīdiem un glikoproteīniem.Iekšpusē proteīna kapsīds iesaiņo tajā RNS, tādējādi aizsargājot viegli noārdāmo RNS (P1).

zfgd

P1 SARS-COV-2 struktūra

Vīrusi iebrūk šūnās caur specifiskiem šūnu virsmas receptoriem, lai izraisītu infekciju, un izmanto saimniekšūnas, lai replicētu.

Vīrusu nukleīnskābju noteikšanas princips ir pakļaut vīrusa RNS caur šūnu lizātu un pēc tam noteikšanai izmantot reāllaika fluorescējošu reversās transkripcijas-polimerāzes ķēdes reakciju (RT-PCR).

Noteikšanas principa atslēga ir izmantot primerus un zondes, lai panāktu nukleīnskābju sekvenču “mērķtiecīgu saskaņošanu”, tas ir, lai atrastu SARS-CoV-2 nukleīnskābju secību, kas atšķiras no citiem vīrusiem aptuveni 30 000 bāzēs (nukleīnskābes līdzība ar citiem vīrusiem), “zems” apgabals), izstrādāt praimerus un zondes.

Praimeri un zondes ir ļoti saskaņoti ar specifisko SARS-CoV-2 nukleīnskābes reģionu, tas ir, specifika ir ļoti spēcīga.Kad pārbaudāmā parauga reāllaika fluorescējošās RT-PCR amplifikācijas rezultāts ir pozitīvs, tas pierāda, ka paraugā ir SARS-CoV-2.Skatīt P2.

zfgd2

SARS-CoV-2 nukleīnskābju noteikšanas P2 soļi (reālā laika fluorescējošā RT-PCR)

Laboratorijas nosacījumi un prasības SARS-CoV-2 nukleīnskābju noteikšanai

Nukleīnskābju testēšanas laboratorijas ir vispiemērotākās negatīva spiediena vidē, un tām jāpievērš uzmanība spiediena uzraudzībai, gaisa plūsmai un aerosolu likvidēšanai.Nukleīnskābju testēšanas personālam ir jābūt atbilstošai kvalifikācijai, jāsaņem atbilstoša polimerāzes ķēdes reakcijas apmācība un jānokārto novērtējums.Laboratorija ir stingri jāpārvalda, jāiedala vietā, un neatbilstošam personālam tajā ir stingri aizliegts iekļūt.Tīrā vieta ir jāvēdina un jādezinficē vietā.Attiecīgie priekšmeti tiek novietoti zonās, tīrie un netīrie tiek atdalīti, laicīgi nomainīti un vietā attīrīti.Regulāra dezinfekcija: hloru saturošs dezinfekcijas līdzeklis ir galvenais risinājums lielākām platībām, un nelielām platībām var izmantot 75% spirtu.Labs veids, kā tikt galā ar aerosoliem, ir atvērt logus ventilācijai, un gaisa dezinfekciju var veikt arī ar ultravioletajiem stariem, filtrēšanu un gaisa dezinfekciju.

SARS-CoV-2 nukleīnskābju noteikšanas galvenās saites un parametri (reālā laika fluorescējošā RT-PCR)

Lai gan laboratorijas parasti pievērš lielu uzmanību nukleīnskābju “atklāšanai”, patiesībā nukleīnskābju “ekstrakcija” ir arī viens no galvenajiem soļiem veiksmīgai noteikšanai, kas ir cieši saistīts ar vīrusu paraugu savākšanu un uzglabāšanu.

Šobrīd visplašāk izmantotajos elpceļu paraugos, piemēram, nazofaringijas uztriepes, tiek izmantota otrā metode, kas ir inaktivācijas (konservēšanas) šķīdums, kas sagatavots, pamatojoties uz nukleīnskābju ekstrakcijas un līzes šķīdumu.No vienas puses, šis vīrusa konservēšanas šķīdums var denaturēt vīrusa proteīnu, zaudēt savu aktivitāti un vairs nebūt infekciozs, kā arī uzlabot transportēšanas un noteikšanas stadijas drošību;no otras puses, tas var tieši uzlauzt vīrusu, lai atbrīvotu nukleīnskābi, likvidētu nukleīnskābi sadalošo fermentu un novērstu vīrusu.RNS tiek degradēta.

Vīrusa paraugu ņemšanas šķīdums, kas sagatavots, pamatojoties uz nukleīnskābju ekstrakcijas līzes šķīdumu.Galvenās sastāvdaļas ir sabalansētie sāļi, etilēndiamīntetraetiķskābes helātu veidotājs, guanidīna sāls (guanidīna izotiocianāts, guanidīna hidrohlorīds u.c.), anjonu virsmaktīvā viela (dodekāns) Nātrija sulfāts), katjonu virsmaktīvā viela (tetradeciltrimetilammonija oksalāts, dihidrogēnioksioksalāts, dihidrogēnoksionoksalāts8). citas vairākas vai vairākas sastāvdaļas.Pašlaik ir daudz veidu nukleīnskābju ekstrakcijas komplekti, un tiek izmantoti dažādi nukleīnskābju ekstrakcijas un attīrīšanas reaģenti.Pat ja tiek izmantots viens un tas pats nukleīnskābes ekstrakcijas un attīrīšanas reaģents, katra komplekta ekstrakcijas procedūras ir atšķirīgas.

Pašlaik Nacionālās medicīnas produktu pārvaldes apstiprinātie nukleīnskābju noteikšanas komplekta produkti tiek atlasīti, pamatojoties uz ORF1ab, E un N gēniem SARS-CoV-2 genomā.Dažādu izstrādājumu noteikšanas principi būtībā ir vienādi, taču to grunti un zondes konstrukcijas atšķiras.Ir viena mērķa segmenti (ORF1ab), divu mērķu segmenti (ORF1ab, N vai E) un trīs mērķa segmenti (ORF1ab, N un E).Atšķirība starp noteikšanu un interpretāciju, nukleīnskābju ekstrakciju un reāllaika fluorescējošu RT-PCR reakcijas sistēmu ir jāatsaucas uz attiecīgā komplekta instrukcijām, un lietotājiem ieteicams stingri ievērot interpretācijas metodi, kas norādīta komplekta interpretācijas instrukcijās.Kopējie reģioni, primeri un zondes sekvences, kas pastiprinātas ar reāllaika fluorescējošu RT-PCR, ir parādītas P3.

zfgd3

P3 SARS-CoV-2 amplikona mērķa atrašanās vieta genomā un praimeru un zondu secība

SARS-CoV-2 nukleīnskābju noteikšanas rezultātu interpretācija (REal-Time fluorescējošā RT-PCR)

“Pneimonijas profilakses un kontroles plāns SARS-CoV-2 infekcijai (otrais izdevums)” pirmo reizi precizēja kritērijus viena gēna amplifikācijas rezultātu vērtēšanai:

1. Nav Ct vai Ct≥40 ir negatīvs;

2. Ct<37 ir pozitīvs;

3. Ct vērtība 37–40 ir pelēkās skalas zona.Ieteicams eksperimentu atkārtot.Ja rezultātam, pārtaisot Ct<40 un amplifikācijas līknei ir acīmredzamas virsotnes, paraugs tiek vērtēts kā pozitīvs, pretējā gadījumā tas ir negatīvs.

Trešais ceļveža izdevums un ceturtais ceļveža izdevums turpināja iepriekš minētos kritērijus.Tomēr, ņemot vērā dažādus komerciālajos komplektos izmantotos mērķus, iepriekšminētajā rokasgrāmatas 3. izdevumā nav doti kritēriji mērķu kombinācijas noteikšanai, uzsverot, ka noteicošie ir ražotāja sniegtie norādījumi.Sākot no vadlīniju piektā izdevuma, ir precizēti divi mērķi, jo īpaši sprieduma kritēriji vienam mērķim, par kuru ir grūti spriest.Tas ir, ja laboratorija vēlas apstiprināt, ka SARS-CoV-2 nukleīnskābju noteikšanas gadījums ir pozitīvs, ir jāievēro 1 no 2 nosacījumiem:

(1) Divi SARS-CoV-2 mērķi (ORF1ab, N) vienā paraugā ir pozitīvi pārbaudīti ar reāllaika fluorescējošu RT-PCR.Ja viens mērķis ir pozitīvs, ir nepieciešama atkārtota paraugu ņemšana un atkārtota pārbaude.Ja testa rezultāti ir Ja viens mērķis joprojām ir pozitīvs, tas tiek uzskatīts par pozitīvu.

(2) Divi reāllaika fluorescējošās RT-PCR paraugi uzrādīja vienu mērķa pozitīvu vienlaikus vai divi viena veida paraugi uzrādīja vienu mērķa pozitīvu testa rezultātu, ko var uzskatīt par pozitīvu.Tomēr vadlīnijās arī uzsvērts, ka negatīvie nukleīnskābju testu rezultāti nevar izslēgt SARS-CoV-2 infekciju.Ir jāizslēdz faktori, kas var izraisīt viltus negatīvus rezultātus, tostarp slikta paraugu kvalitāte (elpceļu paraugi no mutes un rīkles un citām daļām), pārāk agri vai pārāk vēlu paraugu ņemšana, paraugi netika pareizi uzglabāti, transportēti un apstrādāti, kā arī pašai tehnoloģijai bija problēmas (vīrusu variācijas, PCR inhibīcija) utt.

Viltus negatīvu rezultātu cēloņi SARS-CoV-2 noteikšanā

Patlaban izmantotais jēdziens “viltus negatīvs” nukleīnskābju testēšanā bieži attiecas uz “viltus negatīviem”, kuros nukleīnskābju testa rezultāti neatbilst klīniskajām izpausmēm, tas ir, klīniskie simptomi un attēlveidošanas rezultāti ir ļoti aizdomīgi par Covid-19, bet nukleīnskābju testi vienmēr ir daudzkārt “negatīvi”.Nacionālās veselības komisijas Klīniskās laboratorijas centrs skaidroja “viltus negatīvu” SARS-CoV-2 testu.

(1) Inficētās personas šūnās ir noteikts vīrusa daudzums.Esošie dati liecina, ka pēc tam, kad organisms ir inficēts ar vīrusu, vīruss caur degunu un muti iekļūst rīklē, pēc tam trahejā un bronhos un pēc tam sasniedz alveolas.Inficētā persona piedzīvos inkubācijas periodu, vieglus simptomus un pēc tam smagu simptomu procesu un dažādas slimības stadijas.Un vīrusa daudzums dažādās ķermeņa daļās ir atšķirīgs.

Runājot par šūnu tipu vīrusu slodzi, alveolārās epitēlija šūnas (apakšējie elpceļi)> elpceļu epitēlija šūnas (augšējie elpceļi)> fibroblasti, endotēlija šūnas un makrofāgi utt.;no parauga veida, alveolārais skalošanas šķidrums (Visizcilākais)>dziļi klepojot krēpas>nazofaringeāla uztriepe>orofaringeāla uztriepe>asinis.Turklāt vīrusu var noteikt arī izkārnījumos.Tomēr, ņemot vērā operācijas ērtību un pacientu pieņemšanu, biežāk izmantotā klīniskā paraugu secība ir orofaringeāla uztriepe>nazofaringeāla uztriepe>bronhu skalošanas šķidrums (sarežģīta operācija) un dziļas krēpas (parasti sauss klepus, grūti iegūt).

Tādēļ dažiem pacientiem vīrusa daudzums orofarneksa vai nazofarneksa šūnās ir neliels vai ārkārtīgi zems.Ja testēšanai tiek ņemti tikai orofarneksa vai nazofarneksa paraugi, vīrusa nukleīnskābe netiks atklāta.

(2) Paraugu ņemšanas laikā netika savāktas vīrusus saturošas šūnas, vai vīrusa nukleīnskābe netika efektīvi saglabāta.

[① Nepareiza savākšanas vieta, piemēram, vācot orofaringālās uztriepes, savākšanas dziļums nav pietiekams, savāktie nazofaringeālie uztriepes netiek savākti dziļi deguna dobumā utt. Lielākā daļa savākto šūnu var būt bezvīrusu šūnas;

②Paraugu ņemšanas tamponi tiek izmantoti nepareizi.Piemēram, tamponu galvas materiālam ir ieteicamas sintētiskās šķiedras, piemēram, PE šķiedra, poliestera šķiedra un polipropilēna šķiedra.Dabiskās šķiedras, piemēram, kokvilna, tiek izmantotas faktiskajā darbībā (spēcīga proteīna adsorbcija un nav viegli izskalojamas) un neilona šķiedras (slikta ūdens uzsūkšanās, kas izraisa nepietiekamu paraugu ņemšanas apjomu);

③ Nepareiza vīrusu uzglabāšanas tūbiņu izmantošana, piemēram, nepareiza polipropilēna vai polietilēna plastmasas uzglabāšanas tūbiņu izmantošana, kas viegli absorbē nukleīnskābes (DNS/RNS), kā rezultātā samazinās nukleīnskābes koncentrācija uzglabāšanas šķīdumā.Praksē vīrusu nukleīnskābju uzglabāšanai ieteicams izmantot polietilēna-propilēna polimēru plastmasu un dažus īpaši apstrādātus polipropilēna plastmasas traukus.]

[① Nepareiza savākšanas vieta, piemēram, vācot orofaringālās uztriepes, savākšanas dziļums nav pietiekams, savāktie nazofaringeālie uztriepes netiek savākti dziļi deguna dobumā utt. Lielākā daļa savākto šūnu var būt bezvīrusu šūnas;

②Paraugu ņemšanas tamponi tiek izmantoti nepareizi.Piemēram, tamponu galvas materiālam ir ieteicamas sintētiskās šķiedras, piemēram, PE šķiedra, poliestera šķiedra un polipropilēna šķiedra.Dabiskās šķiedras, piemēram, kokvilna, tiek izmantotas faktiskajā darbībā (spēcīga proteīna adsorbcija un nav viegli izskalojamas) un neilona šķiedras (slikta ūdens uzsūkšanās, kas izraisa nepietiekamu paraugu ņemšanas apjomu);

③ Nepareiza vīrusu uzglabāšanas tūbiņu izmantošana, piemēram, nepareiza polipropilēna vai polietilēna plastmasas uzglabāšanas tūbiņu izmantošana, kas viegli absorbē nukleīnskābes (DNS/RNS), kā rezultātā samazinās nukleīnskābes koncentrācija uzglabāšanas šķīdumā.Praksē vīrusu nukleīnskābju uzglabāšanai ieteicams izmantot polietilēna-propilēna polimēru plastmasu un dažus īpaši apstrādātus polipropilēna plastmasas traukus.]

(4) Klīniskās laboratorijas darbība nav standartizēta.Paraugu transportēšanas un uzglabāšanas apstākļi, standartizēta klīnisko laboratoriju darbība, rezultātu interpretācija un kvalitātes kontrole ir galvenie faktori, lai nodrošinātu testu rezultātu precizitāti un ticamību.Saskaņā ar Nacionālās veselības komisijas Klīniskās laboratorijas centra 2020.gada 16.-24.martā veiktās ārējās kvalitātes novērtēšanas rezultātiem no 844 laboratorijām, kas saņēmušas derīgus rezultātus, 701 (83,1%) bija kvalificētas, bet 143 (16,9%) nebija.Kvalificēti, vispārējie laboratorijas testēšanas apstākļi ir labi, taču dažādās laboratorijās joprojām ir atšķirības personāla darbības spējās, viena mērķa pozitīvā parauga interpretācijas spējās un kvalitātes kontrolē.

Kā samazināt SARS-CoV-2 nukleīnskābju noteikšanas viltus negatīvo rezultātu?

Viltus negatīvu rezultātu samazināšana nukleīnskābju noteikšanā ir jāoptimizē no četriem viltus negatīvu radīšanas aspektiem.

(1) Inficētās personas šūnās ir noteikts vīrusa daudzums.Aizdomās par inficēto personu dažādās ķermeņa daļās vīrusa koncentrācija dažādos laikos būs atšķirīga.Ja rīkles nav, tas var būt bronhu skalošanas šķidrumā vai izkārnījumos.Ja testēšanai var savākt vairāku veidu paraugus vienlaikus vai dažādos slimības progresēšanas posmos, tas palīdzēs izvairīties no viltus negatīviem rezultātiem.

(2) Paraugu ņemšanas laikā jāsavāc vīrusu saturošas šūnas.Šo problēmu lielā mērā var atrisināt, pastiprinot paraugu vācēju apmācību.

(3) Uzticami IVD reaģenti.Veicot pētījumus par reaģentu noteikšanas veiktspējas novērtēšanu valsts līmenī un pārrunājot esošās problēmas, var vēl vairāk uzlabot reaģentu noteikšanas efektivitāti un uzlabot analīzes jutīgumu.

(4) Klīnisko laboratoriju standartizēta darbība.Pastiprinot laboratorijas personāla apmācību, nepārtraukti pilnveidojot laboratorijas kvalitātes vadības sistēmu, nodrošinot saprātīgu sadalījumu un uzlabojot personāla atklāšanas spēju, ir iespējams samazināt nepareizas laboratorijas darbības dēļ viltus negatīvus.

Iemesli atkārtotai SARS-CoV-2 nukleīnskābes testa pozitīvai pārbaudei atveseļotiem un izrakstītiem pacientiem

“COVID-19 diagnostikas un ārstēšanas plāns (septītais izmēģinājums)” skaidri nosaka, ka viens no kritērijiem COVID-19 pacientu izārstēšanai un izrakstīšanai no slimnīcas ir tas, ka diviem secīgiem elpceļu paraugiem ir negatīvs nukleīnskābju tests (ar vismaz 24 stundu starplaiku), taču ir ļoti maz pacientu, kuriem SARS-CoV-2 nukleīnskābju izraksts atkal bija pozitīvs.

(1)SARS-CoV-2 ir jauns vīruss.Ir nepieciešams sīkāk izprast tā patogēno mehānismu, pilnu izraisītās slimības priekšstatu un slimības gaitas īpašības.Līdz ar to, no vienas puses, nepieciešams pastiprināt izrakstīto pacientu vadību un veikt 14 dienu medicīnisko novērošanu.Veikt novērošanu, veselības uzraudzību un veselības norādes, lai padziļinātu izpratni par visu slimības rašanās, attīstības un iznākuma procesu.

(2) Pacients var atkārtoti inficēties ar vīrusu.Akadēmiķis Džuns Naņšans sacīja: Tā kā izārstētajiem pacientiem ir antivielas, SARS-CoV-2 var izvadīt ar antivielām, kad tās atkal iebrūk.Ir daudz iemeslu, kas var būt atveseļotā pacienta cēlonis, vai arī tas var būt saistīts ar vīrusa mutāciju vai pat laboratorisko izmeklējumu cēlonis.Ja tas ir pats vīruss, SARS-CoV-2 mutācija var izraisīt atveseļotā pacienta ražotās antivielas neefektivitāti pret mutācijas vīrusu.Ja pacients atkal tiek inficēts ar mutācijas vīrusu, nukleīnskābes tests atkal var būt pozitīvs.

(3) Kas attiecas uz laboratorijas testēšanas metodēm, katrai testēšanas metodei ir savi ierobežojumi.SARS-CoV-2 nukleīnskābju noteikšana ir saistīta ar gēnu secības izvēli, reaģentu sastāvu, metodes jutīgumu un citiem iemesliem, kā rezultātā esošajiem komplektiem ir savas zemākās noteikšanas robežas.Pēc pacienta ārstēšanas vīruss organismā samazinās.Kad vīrusu slodze pārbaudāmajā paraugā ir zemāka par zemāko noteikšanas robežu, parādīsies “negatīvs” rezultāts.Tomēr šis rezultāts nenozīmē, ka vīruss organismā ir pilnībā pazudis.Vīruss var būt pēc ārstēšanas pārtraukšanas.Atdzimšana”, turpiniet kopēt.Tāpēc ieteicams pārskatīt reizi nedēļā 2 līdz 4 nedēļu laikā pēc izrakstīšanās.

(4) Nukleīnskābe ir vīrusa ģenētiskais materiāls.Vīruss tiek nogalināts pēc tam, kad pacientam ir veikta pretvīrusu ārstēšana, bet atlikušie vīrusa RNS fragmenti joprojām saglabājas cilvēka organismā un netiek pilnībā izvadīti no organisma.Dažreiz noteiktos apstākļos to var saglabāt vairāk.Ilgu laiku, un šajā laikā nukleīnskābju tests būs “pārejoši” pozitīvs.Pagarinot pacienta atveseļošanās laiku, pēc tam, kad organismā ir pakāpeniski izsmelti atlikušie RNS fragmenti, nukleīnskābju testa rezultāts var kļūt negatīvs.

(5) SARS-CoV-2 nukleīnskābju testa rezultāts pierāda tikai vīrusa RNS esamību vai neesamību, bet nevar pierādīt vīrusa aktivitāti un to, vai vīruss ir transmisīvs.Ir jāpierāda, vai pacients, kuram atkal ir pozitīvs nukleīnskābju tests, atkal kļūs par infekcijas avotu.Ir nepieciešams veikt vīrusa kultūru uz klīniskiem paraugiem un kultivēt “dzīvu” vīrusu, lai pierādītu, ka tas ir infekciozs.

Kopsavilkums

Rezumējot, nevar pilnībā izvairīties no SARS-CoV-2 nukleīnskābes testa kļūdaini negatīviem rezultātiem, atkārtota testa pozitīvajiem rezultātiem un citiem apstākļiem, kas neatbilst klīniskajām izpausmēm.Faktiskajā skrīningā un testēšanā ir ieteicams apvienot klīniskos simptomus, attēlveidošanas izmeklējumus (CT) un eksperimentus Laboratorijas testu (nukleīnskābju tests + vīrusa specifisko antivielu tests) rezultātus visaptverošai diagnostikai, lai novērstu nepareizu diagnozi un nepareizu diagnozi.Ja tiek konstatēts, ka testa rezultāti acīmredzami neatbilst klīniskajām izpausmēm, ieteicams veikt visaptverošu visas testa saites (paraugu ņemšanas, aprites un apstrādes saites) analīzi, lai izslēgtu SARS-CoV-2 vīrusa agrīnu infekciju, atkārtotu infekciju vai kombināciju ar citām elpceļu vīrusu infekcijām utt.Ja apstākļi atļauj, atkārtotai pārbaudei ieteicams savākt jutīgākus paraugus, piemēram, krēpu vai alveolāro skalošanas šķidrumu.

Saistītie produkti:

SARS-CoV-2 nukleīnskābes noteikšanas komplekts (multipleksā PCR fluorescējošās zondes metode)


Publicēšanas laiks: 03.09.2021