• facebook
  • linkedin
  • youtube

Praimeru un zondu veiktspējas pārbaude PCR reaģentu agrīnā stadijā un vispiemērotāko reakcijas apstākļu noteikšana ir priekšnoteikumi, lai nodrošinātu formālo eksperimentu vienmērīgu norisi.

Tātad, kā mums ir jāapstiprina gruntēšanas zonde agrīnā stadijā?

Galvenie rādītāji ir bāzes līnija, amplifikācijas līkne, ct vērtība, pastiprināšanas efektivitāte, zemas koncentrācijas parauga noteikšana, CV utt.

Pamatlīnija

Bāzes līnija ir horizontālā līnija PCR amplifikācijas līknē.Pirmajos dažos PCR amplifikācijas reakcijas ciklos fluorescences signāls daudz nemainās un veido taisnu līniju.Šī taisnā līnija ir bāzes līnija.

Pārbaudot PCR primer zondes, pievērsiet uzmanību tam, vai bāzes līnija ir vienāda.Praimera zondes koncentrācijas tīrība ietekmēs bāzes līniju, piemēram, izraisīs bāzes līnijas paaugstināšanos vai kritumu.Bāzes līnija ir arī ļoti intuitīvs rādītājs.
Analīze

Pastiprināšanas līkne

Vēl viens intuitīvs rādītājs ir pastiprināšanas līknes forma.Vislabāk ir izmantot S formas līkni, lai izvairītos no sekundārās pastiprināšanas vai citām neparastām pastiprināšanas līknēm.
null

Ct vērtība

Ciklu skaits, kas atbilst lēciena punktam no bāzes līnijas līdz eksponenciālajam pieaugumam, ir Ct vērtība.

Vienam un tam pašam paraugam dažādas primer zondes rada dažādas amplifikācijas līknes, un atbilstošo Ct vērtību ietekmēs pastiprināšanas efektivitāte un traucējumu pakāpe.Teorētiski, jo mazāka ir mūsu izvēlētās primer zondes Ct vērtība, jo labāk.

Analīze-3

Pastiprināšanas efektivitāte

Viena no uzticamākajām un stabilākajām metodēm PCR amplifikācijas efektivitātes novērtēšanai ir standarta līkne, ko plaši atzīst arī pētnieki.Metode ietver paraugu sērijas izveidi, lai kontrolētu mērķa veidņu relatīvo skaitu.Šos paraugus parasti gatavo, sērijveidā atšķaidot koncentrētus izejas šķīdumus, visbiežāk izmanto 10-kārtīgu atšķaidījumu.Izmantojot virkni atšķaidītu paraugu, izmantojot standarta qPCR programmu, lai pastiprinātu, lai iegūtu Cq vērtību, un visbeidzot uzzīmējiet standarta līkni atbilstoši katra parauga koncentrācijai un atbilstošajai Cq vērtībai, lai iegūtu lineāro vienādojumu Cq= -klgX0+b un pastiprināšanas efektivitāti E=10(-1 /k)-1.Izmantojot qPCR kvantitatīvās analīzes veikšanai, amplifikācijas efektivitātei ir jābūt diapazonā no 90% līdz 110% (3,6>k>3,1).

Analīze-4

Zemas koncentrācijas paraugu noteikšana

Ja parauga koncentrācija ir zema, dažādu primer zondu noteikšanas ātrums ir atšķirīgs.Mēs atlasām 20 zemas koncentrācijas paraugus, ko replicēt, un vislabākā ir primer-zondes sistēma ar augstāko noteikšanas ātrumu.

Analīze-5

Variācijas koeficients (CV)

10 dublētus paraugus var noteikt ar dažādām praimeru zondēm atbilstoši nukleīnskābju amplifikācijas noteikšanas reaģenta līnijas standartam.

Analīze-6

Kvantitatīvie reaģenti:
Precizitāte
Precizitātei vienas partijas ietvaros jāatbilst: testa koncentrācijas logaritmiskās vērtības variācijas koeficients (CV,%) ir ≤5%.Ja parauga koncentrācija ir zema, noteikšanas koncentrācijas logaritma variācijas koeficients (CV,%) ir ≤10%.


Kvalitatīvie reaģenti:
Precizitāte
Precizitātei vienā partijā jāatbilst:

(1) Ct vērtības variācijas koeficients (CV,%) ≤5%

Viens un tas pats paraugs tiek testēts paralēli 10 reizes, un testa rezultātiem jābūt konsekventiem


Izlikšanas laiks: 18. septembris 2021