• facebook
  • linkedin
  • youtube

 Fluorescences kvantitatīvā PCR (pazīstama arī kā TaqMan PCR, turpmāk tekstā FQ-PCR) ir jauna nukleīnskābju kvantitatīvā tehnoloģija, ko 1995. gadā izstrādāja PE (Perkin Elmer) ASV. Šīs tehnoloģijas pamatā ir parastā PCR, pievienojot fluorescējoši iezīmētas zondes.Salīdzinot ar elastīgo PCR, FQ-PCR ir daudz priekšrocību, lai realizētu savu kvantitatīvo funkciju.Šajā rakstā ir paredzēts īsi aprakstīt tehnoloģijas īpašības, principus, metodes un pielietojumu.

1 Funkcijas

FQ-PCR ir ne tikai augsta parastā PCR jutība, bet arī fluorescējošu zondu izmantošanas dēļ, tas var tieši noteikt fluorescējošā signāla izmaiņas PCR pastiprināšanas laikā, izmantojot fotoelektriskās vadīšanas sistēmu, lai iegūtu kvantitatīvus rezultātus, kas novērš daudzus tradicionālās PCR trūkumus, tāpēc tai ir arī augsta DNS hibridizācijas specifika un augsta specifika.

Piemēram, vispārīgie PCR produkti ir jānovēro ar agarozes gēla elektroforēzi un krāsošanu ar etīdija bromīdu ar ultravioleto gaismu vai ar poliakrilamīda gēla elektroforēzi un sudraba krāsošanu.Tas prasa ne tikai vairākus instrumentus, bet arī laiku un pūles.Izmantotie traipi Etīdija bromīds ir kaitīgs cilvēka ķermenim, un šīs sarežģītās eksperimentālās procedūras sniedz iespēju iegūt piesārņojumu un viltus pozitīvus rezultātus.Tomēr FQ-PCR vāks ir jāatver tikai vienu reizi parauga ielādes laikā, un turpmākais process ir pilnībā slēgta caurule, kam nav nepieciešama PCR pēcapstrāde, izvairoties no daudziem trūkumiem parastajās PCR darbībās.Eksperimentā parasti tiek izmantots ABI7100 PCR termocikleris, ko izstrādājis uzņēmums PE.

Instrumentam ir šādas īpašības: ① Plašs pielietojums: to var izmantot DNS un RNS PCR produktu kvantitatīvai noteikšanai, gēnu ekspresijas izpētei, patogēnu noteikšanai un PCR apstākļu optimizēšanai.② Unikāls kvantitatīvs princips: izmantojot fluorescējoši marķētas zondes, fluorescences daudzums uzkrāsies ar PCR ciklu pēc lāzera ierosmes, lai sasniegtu kvantitatīvās noteikšanas mērķi.③ Augsta darba efektivitāte: iebūvēts 9600 PCR termiskais cikleris, ar datoru kontrolēts 1 līdz 2 stundas, lai automātiski un sinhroni pabeigtu 96 paraugu pastiprināšanu un kvantitatīvo noteikšanu.④ Nav nepieciešama gēla elektroforēze: paraugs nav jāatšķaida un elektroforēze, vienkārši izmantojiet īpašu zondi, lai noteiktu tieši reakcijas mēģenē.⑤ Cauruļvadā nav piesārņojuma: tiek izmantota unikālā pilnībā slēgtā reakcijas caurule un fotoelektriskās vadīšanas sistēma, tāpēc nav jāuztraucas par piesārņojumu.⑥Rezultāti ir reproducējami: kvantitatīvais dinamiskais diapazons ir līdz piecām lieluma kārtām.Tāpēc, kopš šī tehnoloģija tika veiksmīgi izstrādāta, to ir novērtējuši daudzi zinātniskie pētnieki un tā ir pielietota daudzās jomās.

2 Principi un metodes

FQ-PCR darbības princips ir izmantot Taq enzīma 5′→3′ eksonukleāzes aktivitāti, lai PCR reakcijas sistēmai pievienotu fluorescējoši iezīmētu zondi.Zonde var specifiski hibridizēties ar DNS veidni, kas atrodas primera secībā.Zondes 5′gals ir marķēts ar fluorescences emisijas gēnu FAM (6-karboksifluoresceīns, fluorescences emisijas maksimums pie 518 nm), bet 3′gals ir marķēts ar The fluorescence kvenching group TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine, thebe ginning2 fluorkence) ir fosforilēts, lai novērstu zondes pagarināšanu PCR amplifikācijas laikā.Kad zonde paliek neskarta, slāpētāju grupa nomāc emitējošās grupas fluorescences emisiju.Kad izstarojošā grupa ir atdalīta no slāpējošās grupas, inhibīcija tiek atcelta, un optiskais blīvums pie 518 nm palielinās, un to nosaka fluorescences noteikšanas sistēma. Renaturācijas fāzē zonde hibridizējas ar veidnes DNS, un pagarinājuma fāzē esošais Taq enzīms pārvietojas pa DNS veidni ar primera pagarinājumu.Kad zonde ir nogriezta, tiek atbrīvots dzēšanas efekts un tiek atbrīvots fluorescējošais signāls.Katru reizi, kad tiek kopēta veidne, tiek nogriezta zonde, ko papildina fluorescējoša signāla atbrīvošana.Tā kā pastāv savstarpēja saistība starp atbrīvoto fluoroforu skaitu un PCR produktu skaitu, šo metodi var izmantot, lai precīzi noteiktu veidnes daudzumu.Eksperimentālajā instrumentā parasti tiek izmantots ABI7100 PCR termociklers, ko izstrādājis uzņēmums PE, un var izmantot arī citus termociklus.Ja eksperimentā tiek izmantota reakcijas tipa reakcijas sistēma ABI7700, pēc reakcijas pabeigšanas kvantitatīvos rezultātus var iegūt tieši, izmantojot datora analīzi.Ja izmantojat citus termociklus, ir jāizmanto fluorescences detektors, lai vienlaicīgi izmērītu fluorescences signālu reakcijas mēģenē, lai aprēķinātu RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ apzīmē parauga caurules fluorescējošās emisijas grupas luminiscences intensitātes attiecību pret dzēšanas grupas luminiscences intensitāti, RQ- apzīmē abu attiecību tukšajā mēģenē, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) apzīmē iegūto rezultātu daudzumu pēc fluorescences signāla izmaiņu kvantitatīvās apstrādes laikā.Pateicoties fluorescējošu zondu ieviešanai, eksperimenta specifika ir ievērojami uzlabota.Zondes konstrukcijai kopumā jāatbilst šādiem nosacījumiem: ①Zondes garumam jābūt aptuveni 20–40 bāzes, lai nodrošinātu saistīšanas specifiku.②GC bāzu saturs ir no 40% līdz 60%, lai izvairītos no atsevišķu nukleotīdu secību dublēšanās.③ Izvairieties no hibridizācijas vai pārklāšanās ar primeriem.④ Saistības stabilitāte starp zondi un veidni ir lielāka par saistīšanās stabilitāti starp grunti un veidni, tāpēc zondes Tm vērtībai jābūt vismaz par 5°C augstākai nekā primera Tm vērtībai.Turklāt zondes koncentrācija, homoloģija starp zondi un veidnes secību, kā arī attālums starp zondi un primeru ietekmē eksperimentālos rezultātus.

Saistītie produkti:

Ķīna Lnc-RT Heroᵀᴹ I (ar gDNāzi) (Super premikss pirmās kārtas cDNS sintēzei no lncRNS) Ražotājs un piegādātājs |Foregene (foreivd.com)

Ķīna Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman ražotājs un piegādātājs |Foregene (foreivd.com)


Publicēšanas laiks: 15. oktobris 2021