• facebook
  • linkedin
  • youtube

1. Nosakiet RNS šķīduma absorbciju

Absorbcija pie 280, 320, 230 un 260 nm atspoguļo attiecīgi nukleīnskābes, fona (šķīduma duļķainības), sāls koncentrācijas un organisko vielu, piemēram, olbaltumvielu, vērtības.Parasti skatiet tikai OD260/OD280 (attiecība, R).Ja 1,8–2,0, mēs domājam, ka olbaltumvielu vai citu organisko vielu piesārņojums RNS var būt pieļaujams, taču jāņem vērā, ka, ja Tris izmanto kā buferi absorbcijas noteikšanai, R vērtība var būt lielāka par 2 (parasti tai jābūt <2,2).Ja R<1,8, olbaltumvielu vai citu organisko vielu piesārņojums šķīdumā ir acīmredzamāks, un RNS likteni var noteikt atbilstoši vajadzībām.Ja R>2,2, tas nozīmē, ka RNS ir hidrolizēta vienā nukleīnskābē.
 
2.RNS elektroforētiskais modelis
Parasti denaturējošo gēlu izmanto RNS elektroforēzei, bet, ja tas ir paredzēts tikai RNS kvalitātes noteikšanai, denaturējošais gēls nav nepieciešams, un var izmantot parasto agarozes gēlu.Elektroforēzes mērķis ir noteikt 28S un 18S joslu integritāti un to attiecību vai mRNS uztriepes integritāti.Parasti, ja 28S un 18S joslas ir spilgtas, skaidras un asas (atsaucoties uz to, ka joslu malas ir skaidras), un 28S spilgtums ir vairāk nekā divas reizes lielāks par 18S joslu, mēs uzskatām, ka RNS kvalitāte ir laba.
Iepriekš minētās ir divas metodes, kuras mēs parasti izmantojam, taču neviena no šīm divām metodēm nevar mums skaidri pateikt, vai RNS šķīdumā ir atlikušā RNāze.Ja šķīdumā ir ļoti mazs RNāzes daudzums, mums ir grūti to noteikt ar iepriekš minēto metodi, bet lielākā daļa turpmāko fermentatīvo reakciju tiek veiktas temperatūrā virs 37 grādiem un ilgstoši.Tādā veidā, ja RNS šķīdumā ir ļoti mazs daudzums RNāzes, tad būs ļoti piemērota vide un laiks, lai spēlētu savu lomu turpmākajos eksperimentos, un, protams, eksperiments šajā laikā būs auksts.Zemāk mēs iepazīstinām ar metodi, kas var apstiprināt, vai RNS šķīdumā ir atlikušā RNāze.
 
3. Siltuma saglabāšanas tests
Atbilstoši parauga koncentrācijai no RNS šķīduma izvelciet divas 1000 ng RNS un pievienojiet to 0,5 ml centrifūgas mēģenē un papildiniet to ar pH 7,0 Tris buferšķīdumu līdz kopējam tilpumam 10 ul, un pēc tam noslēdziet mēģenes vāciņu.Vienu no tiem ielieciet nemainīgas temperatūras ūdens vannā 70°C un turiet siltu 1 stundu.Otru daļu uzglabāja -20°C ledusskapī 1 stundu.Kad laiks ir beidzies, izņemiet divus paraugus elektroforēzei.Kad elektroforēze ir pabeigta, salīdziniet abu elektroforēzes joslas.Ja abu joslas ir konsekventas vai tām nav būtiskas atšķirības (protams, to joslas atbilst arī 2. metodes nosacījumiem), tas nozīmē, ka RNS šķīdumā nav atlikušā RNāzes piesārņojuma, un RNS kvalitāte ir ļoti laba.Gluži pretēji, ja paraugs, kas inkubēts 70 ° C temperatūrā, uzrāda acīmredzamu degradāciju, tas norāda, ka RNS šķīdumā ir RNāzes piesārņojums.
 
2 Eksperimentālās metodes un paņēmieni RNS ekstrakcijai
Problēmas, ar kurām mēs bieži sastopamies, ekstrahējot RNS, ir šādas: (1) RNS iznākums ir zems;(2) RNS ir nopietns sāls piesārņojums;(3) RNS ir nopietns organisko šķīdinātāju piesārņojums;(4) paraugu degradācija un citas problēmas
 
1. Parasti izmantotie kopējās RNS ekstrakcijas reaģenti
Guanidīna izotiocianāta metode un Trizola metode ir visbiežāk izmantotās metodes kopējās RNS ekstrakcijai no dzīvnieku audiem un dzīvnieku šūnām.Tas ir īpaši piemērots maziem paraugiem un audiem, kurus ir īpaši grūti iegūt, piemēram, kopējās RNS ekstrakcijai no truša ādas un dzīvnieku saistaudiem;turklāt Trizol kā vispārējas nozīmes līzes reaģentu var izmantot arī augu audu, baktēriju, sēnīšu un citu audu ekstrakcijai.Augu audiem, kas satur polisaharīdus un polifenolus, piemēram, kamēlijas oleiferas, tējas lapas, rapšu sēklas utt., kopējās RNS ekstrahēšanai var izmantot arī CTAB metodi.

Kā parastā metode, dubulto kolonnu metode ir arī ļoti populāra, jo tā darbojas normālā temperatūrā, nav jāpievieno RNāze un drošība — ekstrahēšanai nav nepieciešams hloroforms, fenoli un citi organiskie reaģenti.(ieteicamie produkti )

1
2

2. Kopējās RNS ekstrakcija no dzīvnieku audiem
 
(1) Mēģiniet izvēlēties svaigus salvetes, ja tās nav svaigas (vēlams trīs mēnešu laikā - 80 ℃ ledusskapī vai sasaldētas šķidrā slāpeklī. Griežot salveti, negrieziet tieši istabas temperatūrā, noteikti novietojiet uz ledus kastes, mēģiniet izvairīties no atkārtotas sasaldēšanas un atkausēšanas.
(2) Izmantojiet tīras šķēres un pincetes, lai nogrieztu nelielu audu gabalu, mēģiniet nogriezt audu centrālo daļu, griežot paraugu, vai vispirms nogrieziet lielo audu gabalu no vidus un pēc tam nogrieziet paraugu svaigā griezuma vietā.Izņemtie audi ir pilnībā jāsasmalcina, sasmalcinātie audi jāievieto EP mēģenē bez RNāzes, jāpievieno lizāts, sasmalcinātie audi ir pilnībā jāpakļauj lizātam un jāsagatavo homogenizācijai.

(3) Normāliem audiem homogenizācijai atlasiet mung pupiņas lieluma audus (30–60 mg).Ja audi satur lielu daudzumu olbaltumvielu, tauku vai blīvu šķiedru audu, piemēram, aknas, atbilstoši palieliniet vai samaziniet sagriezto audu daudzumu (pēc izvēles) Izvēlieties 10–20 mg).
(4) Ja ekstrahē zivju muskuļus, garneļu gaļu, medūzas un citus audus ar augstu ūdens saturu, parauga tilpums ir atbilstoši jāpalielina (ieteicams 100-200 mg).
(5) Ja apstākļi atļauj, dzīvnieku audus var tieši ekstrahēt pēc homogenizācijas ar augstas caurlaidības audu homogenizatoru, ja šādas iekārtas nav.
(6) RNS, kas iegūta pēc galīgās ekstrakcijas, nekavējoties jānovieto uz ledus kastes, lai samazinātu RNS noārdīšanos.

3. Dzīvnieku šūnu RNS ekstrakcija

(1) Suspensijas šūnas: centrifugējiet tieši un izmetiet barotni, mazgājiet ar sterilu PBS 1–2 reizes, pēc tam suspendējiet ar atbilstošu PBS daudzumu un pēc tam pievienojiet lizātu lizēšanai.Nepievienojiet lizātu tieši nogulsnētajām šūnām pēc pilnīgas šķidruma izmešanas.Tas izraisīs histona iepakojuma, kas izdalās pēc lizētām šūnām ārējā slānī, pieķeršanos nogulsnēto šūnu ārpusei, tādējādi ierobežojot granulas iekšpusē esošo šūnu saskari ar lizātu., izraisot nepilnīgu šūnu līzi un samazinātu RNS iznākumu.

(2) Šūnas, kas ir daļēji pielipušas vai nav cieši pielipušas: pēc barotnes izmešanas mazgā ar PBS 1–2 reizes, pēc tam tieši absorbē atbilstošu daudzumu PBS un izpūš kultivēšanas trauku ar pipeti vai pistoli, lai izpūstu šūnas, un pārnes tās uz šūnām, kas nesatur RNS.Pievienojiet lizātu fermenta EP mēģenei ekstrakcijai.

(3) Pielipušās šūnas: vispirms jāsagremo ar tripsīnu, pēc tam savāc RNāzes nesaturošās EP mēģenēs, centrifugē, lai noņemtu supernatantu, 1–2 reizes mazgā ar PBS, lai noņemtu lieko tripsīnu, un atkārtoti suspendē ar atbilstošu daudzumu PBS. Pēc tam pārejiet uz ekstrakcijas posmu.

4. Augu RNS ekstrakcija

Augu audi ir bagāti ar fenola savienojumiem vai bagāti ar polisaharīdiem, vai satur dažus neidentificētus sekundāros metabolītus, vai tiem ir augsta RNāzes aktivitāte.Šīs vielas pēc šūnu līzes tiek cieši savienotas ar RNS, veidojot nešķīstošus kompleksus vai koloidālas nogulsnes, kuras ir grūti noņemt.Tāpēc, ekstrahējot augu audus, mums ir jāizvēlas komplekts augiem.Komplektā esošais lizāts var efektīvi atrisināt problēmas ar vieglu polifenolu oksidēšanu un polisaharīdu savienojumu un nukleīnskābju atdalīšanu.

(Polisaharīdu polifenola augu RNS ekstrakcijai ieteicamie produkti:

(1) Auga miza, mīkstums, sēklas, lapas utt. pilnībā jāsasmalcina javā.Slīpēšanas procesā šķidrais slāpeklis jāpapildina savlaicīgi, lai izvairītos no parauga kušanas.Sasmalcinātais paraugs ātri jāpievieno lizātam un jāsakrata, lai izvairītos no RNS noārdīšanās.

(2) Ar šķiedrvielām bagātiem paraugiem, piemēram, rīsiem un kviešu lapām, ekstrakcijas apjoms ir attiecīgi jāsamazina, pretējā gadījumā audu slīpēšana un līze nebūs pilnīga, kā rezultātā iegūtā RNS būs zema.

(3) Augu audiem ar augstu ūdens saturu, piemēram, granātābolu augļiem, arbūzu augļiem, persiku augļiem utt., parauga lielums ir attiecīgi jāpalielina (100–200 mg nav obligāti).

(4) Augu audiem, piemēram, augu lapām, sakneņiem, cietajiem augļiem un citiem materiāliem, parasti ir ieteicams izmantot šķidro slāpekli, lai rūpīgi iejauktu javas sastāvdaļas un pēc tam pārietu uz ekstrakcijas posmu.Parastie audu homogenizatori var nebūt efektīvi, lai homogenizētu augu audus, un parasti tie nav ieteicami.

5. Piesardzības pasākumi RNS ekstrakcijai

(1) Audu paraugiem jābūt pēc iespējas svaigākiem, lai izvairītos no atkārtotas sasaldēšanas un atkausēšanas.

(2) Ekstrakcijas laikā audiem jābūt pilnībā sasmalcinātiem, un audu daudzums nedrīkst būt pārāk mazs, nemaz nerunājot par pārāk daudz.

(3) Pēc lizāta pievienošanas jāparedz pietiekams inkubācijas laiks, lai paraugs pilnībā izlizētu.

(4) Izmantojot Trizol metodi ekstrakcijai, supernatanta absorbcijas princips pēc stratifikācijas ir "vēlāk ieelpot mazāk nekā ieelpot vairāk", un tas nedrīkst ekstrahēt uz vidējo slāni, pretējā gadījumā tas izraisīs nopietnu genoma DNS piesārņojumu.

(5) Mazgāšanas laikā mazgāšanas šķidrumam pilnībā jāiefiltrējas ap caurules sieniņu, lai nodrošinātu rūpīgu mazgāšanu.

(6) Izmantojot kolonnas ekstrakcijas metodi, papildus kolonnas atdalīšanai pēc mazgāšanas adsorbcijas kolonna arī jānovieto īpaši tīrā stendā un jāpūš 5–10 minūtes, lai organiskais šķīdinātājs pilnībā iztvaicētu līdz sausam.

(7) Pēdējā kolonnas metodes eluēšanā pēc DEPC ūdens pievienošanas tas jāinkubē 3–5 minūtes vai arī DEPC ūdens iepriekš jāuzsilda līdz 60°C, lai palielinātu eluēšanas iznākumu.Tradicionālajā Trizol šķelšanas un izopropanola izgulsnēšanas metodē galīgā RNS tiek izšķīdināta DEPC ūdenī, tāpēc jādod atbilstošs laiks šķīdināšanai, un centrifūgas mēģenes apakšdaļa ir nepārtraukti jāpūš ar pipetes galu.

3 TTrīs Cēloņi un risinājumi zemai RNS koncentrācijai/sliktai kvalitātei
 
1. Ienesīgums ir pārāk zems
Ekstrahētais paraugs ir pārāk zems, kopējais daudzums ir nepietiekams vai ekstrahētais paraugs ir pārāk daudz un līze nav pilnīga;ekstrahēšanai jāizmanto atbilstošas ​​kvalitātes audi vai šūnas, parauga pirmapstrāde ir jāveic labi, un līzei jābūt pietiekamai.
 
2. Genoma atliekas
Ekstrahējot ar Trizol metodi, supernatantu iesūcot vidējā slānī pēc slāņošanas, tiks radīts nopietns genoma piesārņojums;slāņošanai jābūt īpaši uzmanīgiem, lai izvairītos no iesūkšanās vidējā slānī.Ja ekstrakcijai izmanto kolonnas metodi, ekstrakcijai var izvēlēties komplektu, kas satur DNāzi I.Uz membrānas adsorbētā nukleīnskābe tiek tieši sagremota ar DNāzi I, kas var ievērojami samazināt DNS atlikumus.
 
3. RNS degradācija
Tā var būt paša ekstrahētā parauga noārdīšanās vai ekstrakcijas procesa laikā izraisītā degradācija;iespēju robežās RNS ekstrakcijai jāizmanto svaigi paraugi, un savāktie paraugi savlaicīgi jāuzglabā šķidrā slāpeklī vai -80°C ledusskapī, kā arī jāizvairās no atkārtotas sasaldēšanas un atkausēšanas.RNS ekstrakcijas procesā jāizmanto RNāzes/DNāzes nesaturoši uzgaļi, centrifūgas mēģenes un citi materiāli.Ekstrakcijas procesam jābūt pēc iespējas ātrākam.Ekstrahētā RNS jānovieto uz ledus kastes un jāuzglabā -80 temperatūrā.Ja ekstrahētā RNS ir jānosaka ar gēla elektroforēzi, uzreiz pēc ekstrakcijas jāveic elektroforēze, un elektroforēzes buferis jāaizstāj ar tikko sagatavotu.
 
4. Sāls un organisko šķīdinātāju atlikumi
Ekstrakcijas reaģenti satur fenola un guanidīna sāļus, un mazgāšanas šķīdums satur etanolu.Ekstrakcijas procesā lizāts netika pilnībā absorbēts un izmests, un mazgāšanas šķīdums nebija pilnībā izžuvis.Atlikušie sāļi un organiskie šķīdinātāji ir kaitīgi turpmākajai reversajai transkripcijai un PCR.Dažādas inhibīcijas pakāpes, tāpēc audu lizāts ekstrakcijas procesā ir pilnībā jāizņem, un mazgāšanai jābūt pietiekamai, lai varētu mazgāt apkārtējās caurules sienas.Turklāt caurule tiek iztukšota un izpūstas ir nepieciešams solis, kas vēl vairāk samazinās organisko vielu atlikumu.
 
Lai iegūtu papildinformāciju par RNS ekstrakciju, lūdzu, apmeklējiet mūsu vietni:
www.foreivd.com, lai iegūtu vairāk informācijas.

7

Izlikšanas laiks: Dec-01-2022