PCR ir visplašāk izmantotā nukleīnskābju amplifikācijas tehnoloģija, un to plaši izmanto tās jutīguma un specifiskuma dēļ.Tomēr PCR ir nepieciešama atkārtota termiskā denaturācija, un tas nevar atbrīvoties no ierobežojumiem, kas saistīti ar paļaušanos uz instrumentiem un aprīkojumu, kas ierobežo tā pielietojumu klīniskajā lauka pārbaudē.

Kopš 90. gadu sākuma daudzas laboratorijas ir sākušas izstrādāt nemainīgas temperatūras pastiprināšanas tehnoloģiju, kurai nav nepieciešama termiskā denaturācija.Tagad viņi ir izstrādājuši cilpas mediētu izotermiskās amplifikācijas tehnoloģiju, virkņu aizstāšanas izotermiskās amplifikācijas tehnoloģiju, ritošā apļa izotermiskās amplifikācijas tehnoloģiju un atkarību no nukleīnskābju sekvences.Izotermiskās pastiprināšanas tehnoloģija un citas tehnoloģijas. 

Loop mediēta izotermiskā pastiprināšana

Pastiprināšanas princips ir balstīts uz faktu, ka DNS atrodas dinamiskā līdzsvara stāvoklī aptuveni 65 ° C temperatūrā.Kad jebkurš primers ir savienots ar bāzi un paplašināts līdz divpavedienu DNS komplementārajai daļai, otra virkne atdalīsies un kļūs par vienpavedienu.

Šajā temperatūrā DNS izmanto 4 specifiskus primerus, lai paļautos uz DNS polimerāzi ar virknes nobīdi, lai nodrošinātu nepārtrauktu virknes nobīdes DNS sintēzi pašcirkulāciju.

Vispirms nosakiet 6 specifiskos reģionus F3, F2, F1, B1, B2, B3 mērķa gēnā un pēc tam izveidojiet 4 primerus, pamatojoties uz šiem 6 specifiskajiem reģioniem (kā parādīts attēlā zemāk):

Priekšējais iekšējais primer (FIP) sastāv no F1c un F2.

Atpakaļējais iekšējais gruntējums (BIP) sastāv no B1c un B2, un TTTT tiek izmantots kā starplikas vidū.

Ārējie primeri F3 un B3 attiecīgi sastāv no F3 un B3 reģioniem mērķa gēnā.

LAMP reakcijas sistēmā iekšējā grunts koncentrācija ir vairākas reizes lielāka nekā ārējā gruntējuma koncentrācija.Iekšējais praimeris vispirms tiek apvienots ar šablona virkni, lai sintezētu komplementāru virkni, veidojot DNS dubulto virkni.Pēc tam ārējais praimeris tiek apvienots ar šablona virkni, veidojot DNS dubulto virkni.BstDNS polimerāzes iedarbībā tiek atbrīvota komplementārā virkne, ko sintezē iekšējais praimeris.Pēc virknes reakciju komplementārā virkne beidzot veido vienu DNS virkni ar hanteles struktūru.

Hanteles struktūras DNS viena virkne pati par sevi tiek izmantota kā veidne, lai nepārtraukti veidotu pārejas cilmes cilpas struktūras DNS ar atvērtu galu.Iekšējie un ārējie praimeri virza pārejas cilmes cilpas struktūras DNS, lai nepārtraukti izietu virknes pārvietošanas un pagarināšanas reakcijas un visbeidzot veidotu vairākas cilmes cilpas struktūras ar dažādu garumu.DNS maisījums.

Cilpas mediētas izotermiskās pastiprināšanas priekšrocības un trūkumi

LAMP priekšrocības:

(1) Augsta amplifikācijas efektivitāte, kas var efektīvi pastiprināt 1-10 mērķa gēna kopijas 1 stundas laikā, un amplifikācijas efektivitāte ir 10-100 reizes lielāka par parasto PCR.

(2) Reakcijas laiks ir īss, specifika ir spēcīga, un nav nepieciešams īpašs aprīkojums.

LAMP trūkumi:

(1) Prasības gruntskrāsām ir īpaši augstas.

(2) Pastiprināto produktu nevar izmantot klonēšanai un sekvencēšanai, bet to var izmantot tikai sprieduma veikšanai.

(3) Tā spēcīgās jutības dēļ tas viegli veido aerosolus, radot viltus pozitīvus rezultātus un ietekmējot testa rezultātus.

Strand nobīdes pastiprināšana

Strand displacement amplification (SDA) ir in vitro izotermiska DNS amplifikācijas metode, kuras pamatā ir fermentatīvā reakcija, ko pirmo reizi ierosināja amerikāņu zinātnieks Vokers 1992. gadā.

SDA pamatsistēmā ietilpst restrikcijas endonukleāze, DNS polimerāze ar virkņu pārvietošanas aktivitāti, divi primeru pāri, dNTP, kā arī kalcija un magnija joni un bufersistēmas.

Virknes pārvietošanas amplifikācijas princips ir balstīts uz ķīmiski modificētu restrikcijas endonukleāzes atpazīšanas secību abos mērķa DNS galos.Endonukleāze atver spraugu DNS virknes atpazīšanas vietā, un DNS polimerāze paplašina spraugu 3′ galā un aizstāj nākamo DNS virkni.

Aizvietotās atsevišķas DNS virknes var apvienot ar primeriem un ar DNS polimerāzi paplašināt divos pavedienos.Šo procesu atkārto nepārtraukti, lai mērķa secība tiktu efektīvi pastiprināta.

Virsmas nobīdes pastiprināšanas tehnoloģijas priekšrocības un trūkumi

SDA priekšrocības:

Pastiprināšanas efektivitāte ir augsta, reakcijas laiks ir īss, specifika ir spēcīga, un nav nepieciešams īpašs aprīkojums.

SDA trūkumi:

Produkti nav viendabīgi, un daži vienpavedienu un divpavedienu produkti vienmēr tiek ražoti SDA ciklā, un atslāņošanās neizbēgami notiks, ja to nosaka ar elektroforēzi.

Rolinga apļa pastiprināšana

Ritošā apļa amplifikācija (RCA) tiek ierosināta, izmantojot metodi DNS kopēšanai no patogēniem organismiem, izmantojot ritošo apli.Tas attiecas uz vienpavedienu apļveida DNS izmantošanu kā veidni nemainīgā temperatūrā un īpašu DNS polimerāzi (piemēram, Phi29) ) Ritošā apļa DNS sintēzes ietekmē, lai panāktu mērķa gēna amplifikāciju.

RCA var iedalīt lineārajā pastiprināšanā un eksponenciālajā pastiprināšanā.Lineārās RCA efektivitāte var sasniegt 10⁵reizes, un eksponenciālās RCA efektivitāte var sasniegt 10⁹reizes.

Vienkārša atšķirība, kā parādīts zemāk esošajā attēlā, lineārā pastiprināšana a izmanto tikai 1 primeri, eksponenciālajai pastiprināšanai b ir 2 primeri.

Lineāro RCA sauc arī par vienu primeru RCA.Praimeris saistās ar apļveida DNS un tiek paplašināts ar DNS polimerāzes darbību.Produkts ir lineāra viena virkne ar lielu skaitu atkārtotu secību, kas tūkstošiem reižu pārsniedz vienas cilpas garumu.

Tā kā lineārās RCA produkts vienmēr ir savienots ar sākuma grunti, signāla ērtā fiksācija ir galvenā priekšrocība.

Eksponenciālā RCA, kas pazīstama arī kā hiperzarotā amplifikācijas HRCA (hiperzarotā RCA), eksponenciālā RCA gadījumā viens praimeris pastiprina RCA produktu, otrs praimeris hibridizējas ar RCA produktu un izplešas, un aizstāšana jau ir saistīta ar RCA produktu.

Ritošā apļa nukleīnskābju amplifikācijas priekšrocības un trūkumi

RCA priekšrocības:

Augsta jutība, laba specifika un vienkārša darbība.

RCA trūkumi:

Fona problēmas signāla noteikšanas laikā.RCA reakcijas laikā necirkulētā piekaramās slēdzenes zonde un nesaistītās zondes DNS vai RNS veidne var radīt dažus fona signālus. 

Nuz ukleicīdu secību balstīta amplifikācija

Nukleīnskābju sekvences amplifikācija (NASBA) ir jauna tehnoloģija, kas izstrādāta, pamatojoties uz PCR.Tā ir nepārtraukta un izotermiska nukleīnskābes amplifikācija, ko vada primeru pāris ar T7 promotora secību.Tehnoloģija var pastiprināt veidnes RNS aptuveni 109 reizes aptuveni 2 stundu laikā, kas ir 1000 reizes vairāk nekā parastā PCR metode, un tam nav nepieciešams īpašs aprīkojums.

Šī tehnoloģija ir izmantota ātrai slimību diagnostikai, tiklīdz tā parādījās, un daudzi uzņēmumi pašlaik izmanto šo metodi RNS noteikšanas komplektos.

Lai gan RNS pastiprināšanā var izmantot arī reversās transkripcijas PCR tehnoloģiju, NASBA ir savas priekšrocības: to var veikt relatīvi nemainīgas temperatūras apstākļos, un tā ir stabilāka un precīzāka nekā tradicionālā PCR tehnoloģija.

Reakcija notiek 41 grādi pēc Celsija, un, lai pabeigtu, nepieciešama AMV (putnu mieloblastozes vīrusa) reversā transkriptāze, RNāzes H, T7 RNS polimerāze un pāris primeru.

Process galvenokārt ietver:

Priekšējais primer satur T7 promotora komplementāro secību.Reakcijas laikā priekšējais praimeris saistās ar RNS virkni, un to katalizē AMV enzīms, veidojot DNS-RNS dubulto virkni.

RNāze H sagremo RNS hibrīdā dubultā virknē un saglabā vienpavedienu DNS.

Reversā praimera un AMV enzīma iedarbībā veidojas DNS dubultā virkne, kas satur T7 promotora secību.

T7 RNS polimerāzes iedarbībā tiek pabeigts transkripcijas process un tiek ražots liels daudzums mērķa RNS.

NASBA priekšrocības:

(1) Tās primeram ir T7 promotora secība, bet svešai divpavedienu DNS nav T7 promotora sekvences, un to nevar pastiprināt, tāpēc šai tehnoloģijai ir augsta specifika un jutīgums.

(2) NASBA tieši iekļauj reversās transkripcijas procesu amplifikācijas reakcijā, saīsinot reakcijas laiku.

NASBA trūkumi:

(1) Reakcijas sastāvdaļas ir sarežģītākas.

(2) Lai paaugstinātu reakcijas izmaksas, ir nepieciešami trīs veidu fermenti.