Vairāki revolucionāri izgudrojumi noteikšanas tehnoloģiju vēsturē, manuprāt, ir imūnmarķēšanas tehnoloģija, kuras pamatā ir antigēnu-antivielu specifiskās saistīšanās princips, PCR tehnoloģija un sekvencēšanas tehnoloģija.Šodien mēs runāsim par PCR tehnoloģiju.Saskaņā ar PCR tehnoloģijas attīstību cilvēki parasti iedala PCR tehnoloģiju trīs paaudzēs: parastā PCR tehnoloģija, reāllaika fluorescējošā kvantitatīvā PCR tehnoloģija un digitālā PCR tehnoloģija.
Cizplatīta PCR tehnika
KARY MULLIS (1944.12.28.-2019.8.7.)
Karijs Mulliss izgudroja polimerāzes ķēdes reakciju (polimerāzes ķēdes reakciju, PCR) 1983. gadā. Ir teikts, ka, vadot savu draudzeni, viņam pēkšņi uzliesmoja iedvesma un viņš iedomājās PCR principu (par braukšanas priekšrocībām).Karijam Mullisam 1993. gadā tika piešķirta Nobela prēmija ķīmijā. The New York Times komentēja: "Ļoti oriģināls un nozīmīgs, gandrīz sadalot bioloģiju pirms-PCR un pēc-PCR laikmetā.
PCR princips: DNS polimerāzes katalīzē kā veidni tiek izmantota mātes virknes DNS, un kā pagarinājuma sākumpunkts tiek izmantots specifiskais primer, un meitas virknes DNS, kas ir komplementāra ar mātes virknes šablona DNS, tiek kopēta in vitro, izmantojot denaturāciju, atkausēšanu, pagarināšanu un citus posmus.Tā ir DNS sintēzes amplifikācijas tehnoloģija in vitro, kas var ātri un specifiski pastiprināt jebkuru mērķa DNS in vitro.
Parastās PCR priekšrocības
1.Klasiskā metode, pilnīgi starptautiski un vietējie standarti
2.Zemākas instrumentu reaģentu izmaksas
3.PCR produktus var atgūt citiem molekulārās bioloģijas eksperimentiem
Ieteicamā Foregene PCR iekārta: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Saistītie produkti: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Parastās PCR trūkumi
1.viegli piesārņot
2.apgrūtinoša darbība
3.tikai kvalitatīva analīze
4.Vidēja jutība
5.Pastāv nespecifiska pastiprināšana, un, ja nespecifiskā josla ir tāda paša izmēra kā mērķa josla, to nevar atšķirt.
Cuz apilāru elektroforēzi balstīta PCR
Reaģējot uz parastās PCR nepilnībām, daži ražotāji ir ieviesuši instrumentus, kuru pamatā ir kapilārās elektroforēzes princips.Elektroforēzes posms pēc PCR amplifikācijas ir pabeigts kapilārā.Jutība ir lielāka, un MAERKER var atšķirt vairāku bāzu atšķirību un aprēķināt pastiprinājumu.produkta saturs.Trūkums ir tāds, ka PCR produkts joprojām ir jāatver un jāievieto instrumentā, un joprojām pastāv liels piesārņojuma risks.
CapilārsEelektroforēze
2. Reālā laika fluorescējošā kvantitatīvā PCR (Quantitative Real-time PCR, qPCR) tehnoloģijaFluorescējošā kvantitatīvā PCR, saukta arī par reāllaika PCR, ir jauna nukleīnskābju kvantitatīvā tehnoloģija, ko 1995. gadā izstrādāja PE (Perkin Elmer). Fluorescējošās kvantitatīvās PCR attīstības vēsture ir tādu milžu kā ABI, Roche un Bio-Rad dvēseli satricinošu cīņu vēsture.Ja jūs interesē, varat to pārbaudīt.Šī metode pašlaik ir visnobriedušākā un visplašāk izmantotā daļēji kvantitatīvā PCR metode.
Ieteicamā qPCR iekārta: https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
Fluorescējošās krāsošanas metode (SYBR Green I):SYBR Green I ir kvantitatīvā PCR visbiežāk izmantotā DNS saistošā krāsviela, kas nespecifiski saistās ar divpavedienu DNS.Brīvā stāvoklī SYBR Green izstaro vāju fluorescenci, bet, kad tas ir saistīts ar divpavedienu DNS, tā fluorescence palielinās 1000 reizes.Tāpēc kopējais fluorescējošais signāls, ko izstaro reakcija, ir proporcionāls klātesošajam divpavedienu DNS daudzumam un palielināsies, palielinoties pastiprinātajam produktam.Tā kā krāsviela nespecifiski saistās ar divpavedienu DNS, var tikt iegūti viltus pozitīvi rezultāti.
Saistītie produkti: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
Fluorescējošās zondes metode (Taqman tehnoloģija): laikāPCR amplifikācija, specifiska fluorescējoša zonde tiek pievienota vienlaikus ar praimeru pāri.Zonde ir lineārs oligonukleotīds, kura abos galos ir attiecīgi marķēta fluorescējoša reportiera grupa un fluorescējoša slāpētāja grupa.Kad zonde ir neskarta, fluorescējošo signālu, ko izstaro reportieru grupa, absorbē slāpētāja grupa, un noteikšana Nav fluorescējoša signāla;PCR amplifikācijas laikā (paplašināšanas stadijā) Taq enzīma 5'-3' Dicer aktivitāte sagremo un noārdīs zondi, tādējādi reportiera fluorescējošā grupa un slāpētāja fluorescējošā grupa tiek atdalītas tā, ka fluorescences uzraudzības sistēma var tikt uztverta fluorescējošais signāls, tas ir, katru reizi, kad tiek veidota DNS ķēde, tiek veikta fluorescenta amplifikācija, sintezēšana un sintezēšana. fluorescējošu signālu un PCR produktu veidošanos.Taqman zondes metode ir visbiežāk izmantotā noteikšanas metode klīniskajā noteikšanā.
Saistītie produkti: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
qPCR priekšrocības
1.Metode ir nobriedusi, un atbalsta aprīkojums un reaģenti ir pabeigti
2.Vidējas reaģentu izmaksas
3.viegli izmantot
4.Augsta noteikšanas jutība un specifiskums
qPCR trūkumi
Mērķa gēna mutācija noved pie nokavētas noteikšanas.
Zemas koncentrācijas veidnes noteikšanas rezultātu nevar noteikt.
Izmantojot standarta līkni kvantitatīvai noteikšanai, ir liela kļūda.
3. Digitālā PCR (digitālā PCR, dPCR) tehnoloģija
Digitālā PCR ir metode nukleīnskābju molekulu absolūtai kvantitatīvai noteikšanai.Salīdzinot ar qPCR, digitālā PCR var tieši nolasīt DNS/RNS molekulu skaitu, kas ir absolūtais nukleīnskābju molekulu kvantitatīvais novērtējums sākuma paraugā.1999. gadā Berts Vogelsteins un Kenets V. Kinzlers oficiāli ierosināja dPCR koncepciju.
2006. gadā Fluidigm bija pirmais, kas ražoja komerciālu uz mikroshēmu balstītu dPCR instrumentu.2009. gadā uzņēmums Life Technologies izlaida OpenArray un QuantStudio 12K Flex dPCR sistēmas.2013. gadā Life Technologies uzsāka QuantStudio 3DdPCR sistēmu, kas izmanto augsta blīvuma nanomēroga mikrofluidisko mikroshēmu tehnoloģiju, lai vienmērīgi sadalītu paraugus 20 000 atsevišķās šūnās.reakcijas akā.
2011. gadā Bio-Rad laida klajā uz pilienu balstītu QX100 dPCR instrumentu, kas izmanto ūdens eļļā tehnoloģiju, lai vienmērīgi sadalītu paraugu līdz 20 000 pilienu ūdens eļļā, un izmanto pilienu analizatoru, lai analizētu pilienus.2012. gadā RainDance laida klajā RainDrop dPCR instrumentu, ko darbina augstspiediena gāze, lai sadalītu katru standarta reakcijas sistēmu reakcijas emulsijā, kas satur 1 miljonu līdz 10 miljonus pikolitru līmeņa mikropilienu.
Līdz šim digitālais PCR ir izveidojis divas galvenās frakcijas: mikroshēmas tipu un pilienu tipu.Neatkarīgi no digitālā PCR veida, tā pamatprincipi ir ierobežojoša atšķaidīšana, galapunkta PCR un Puasona sadalījums.Standarta PCR reakcijas sistēma, kas satur nukleīnskābju šablonus, ir vienmērīgi sadalīta desmitos tūkstošu PCR reakciju, kuras tiek sadalītas mikroshēmās vai mikropilenēs, lai katra reakcija pēc iespējas saturētu šablonu molekulu, un tiktu veikta vienas molekulas šablona PCR reakcija.Nolasot fluorescenci Signāla esamība vai neesamība tiek skaitīta, un absolūtā kvantitatīvā noteikšana tiek veikta pēc statistiskā Puasona sadalījuma kalibrēšanas.
Tālāk ir norādītas vairāku izmantoto digitālo PCR platformu īpašības:
1. Bio-Rad QX200 pilienu digitālais PCR Bio-RadQX200 ir ļoti klasiska digitālā PCR platforma, pamata noteikšanas process: 20 000 paraugu tiek ģenerēti ar pilienu ģeneratoru Ūdens-eļļā mikropilieni tiek pastiprināti ar parastu PCR iekārtu, un visbeidzot katra mikropiliena fluorescences signālu nolasa mikropilienu lasītājs.Operācija ir sarežģītāka, un piesārņojuma risks ir vidējs.
Xinyi TD1 mikropilienu digitālais PCRXinyi TD1 ir vietējā digitālā PCR platforma, pamata noteikšanas process: ģenerējiet 30 000–50 000 ūdens eļļā pilienu caur pilienu ģeneratoru, pastipriniet ar parasto PCR instrumentu un visbeidzot izlaidiet Pilienu lasītājs nolasa katra piliena fluorescējošu signālu.Gan pilienu ģenerēšana, gan nolasīšana šajā platformā tiek veikta speciālā mikroshēmā ar zemu piesārņojuma risku.
STILLA Naica mikro-pilienu mikroshēmas digitālais PCRSTILLA Naica ir salīdzinoši jauna digitālā PCR platforma.Pamata noteikšanas process ir šāds: pievienojiet reakcijas šķīdumu mikroshēmai, ievietojiet mikroshēmu mikropilienu ģenerēšanas un pastiprināšanas sistēmā un ģenerējiet 30 000 mikropilienu.Izklājiet uz mikroshēmas, un mikroshēmā tiek pabeigta PCR pastiprināšana.Pēc tam pastiprinātā mikroshēma tiek pārnesta uz mikropilienu nolasīšanas analīzes sistēmu, un fluorescējošais signāls tiek nolasīts, uzņemot attēlus.Tā kā viss process notiek slēgtā mikroshēmā, piesārņojuma risks ir zems.
4. ThermoFisher QuantStudio 3D mikroshēmas digitālais PCR
ThermoFisher QuantStudio 3D ir vēl viena klasiska uz mikroshēmām balstīta digitālā PCR platforma.Tās noteikšanas pamatprocess ir šāds: pievienojiet reakcijas šķīdumu izkliedētājam un vienmērīgi izkliedējiet reakcijas šķīdumu uz mikroshēmas ar 20 000 mikroiedobēm caur izkliedētāju., ievietojiet mikroshēmu PCR aparātā, lai pastiprinātu, un visbeidzot ievietojiet mikroshēmu lasītājā un nofotografējiet, lai nolasītu fluorescējošu signālu.Darbība ir salīdzinoši sarežģīta, un viss process tiek veikts slēgtā mikroshēmā, un piesārņojuma risks ir zems.
5. JN MEDSYS Clarity mikroshēmas digitālais PCR
JN MEDSYS Clarity ir salīdzinoši jauna mikroshēmas tipa digitālā PCR platforma.Tās noteikšanas pamatprocess ir šāds: pievienojiet reakcijas šķīdumu aplikatoram un vienmērīgi izkliedējiet reakcijas šķīdumu uz 10 000 PCR caurulēm, kas fiksētas PCR mēģenē caur aplikatoru.Mikroporainajā mikroshēmā reakcijas šķīdums iekļūst mikroshēmā ar kapilāru darbību, un PCR caurule ar mikroshēmu tiek novietota uz PCR iekārtas pastiprināšanai, un visbeidzot mikroshēma tiek ievietota lasītājā, lai nolasītu fluorescējošu signālu, uzņemot fotoattēlu.Operācija ir sarežģītāka.Piesārņojuma risks ir zems.
Katras digitālās PCR platformas parametri ir apkopoti šādi:
Digitālās PCR platformas novērtēšanas rādītāji ir: sadalīto vienību skaits, fluorescējošu kanālu skaits, darbības sarežģītība un piesārņojuma risks.Bet vissvarīgākais ir noteikšanas precizitāte.Viens veids, kā novērtēt digitālās PCR platformas, ir izmantot vairākas digitālās PCR platformas, lai pārbaudītu viena otru, un otrs veids ir izmantot standarta vielas ar precīzām vērtībām.
dPCR priekšrocības
1.Absolūtas kvantifikācijas sasniegšana
2.Augstāka jutība un specifiskums
3.Var noteikt zemu kopiju paraugus
dPCR trūkumi1. Dārgas iekārtas un reaģenti 2. Sarežģīta darbība un ilgs noteikšanas laiks 3. Šaurs noteikšanas diapazons
Pašlaik trīs PCR tehnoloģiju paaudzēm ir savas priekšrocības un trūkumi, un katrai no tām ir savas pielietojuma jomas, un nav attiecības, ka viena paaudze aizstāj otru.Tehnoloģiju nepārtrauktā attīstība ir devusi jaunu dzīvīgumu PCR tehnoloģijā, ļaujot tai atbloķēt vienu lietošanas virzienu pēc otra, padarot nukleīnskābju noteikšanu ērtāku un precīzāku.
Avots: Dr Yuan aizved jūs uz pārbaudi
Ieteicamie produkti:
Izlikšanas laiks: 18. nov. 2022
