一、Palieliniet reakcijas sistēmas jutību:

1. Izolējiet augstas kvalitātes RNS:

Veiksmīgu cDNS sintēzi nodrošina augstas kvalitātes RNS.Augstas kvalitātes RNS jābūt vismaz pilna garuma un bez reversās transkriptāzes inhibitoriem, piemēram, EDTA vai SDS.RNS kvalitāte nosaka maksimālo sekvences informācijas daudzumu, ko varat pārrakstīt cDNS.Izplatīta RNS attīrīšanas metode ir vienpakāpes metode, izmantojot guanidīna izotiocianātu/skābes fenolu.Lai novērstu piesārņojumu ar nelielu daudzumu RNāzes, RNS, kas izolēta no ar RNāzes bagātiem paraugiem (piemēram, aizkuņģa dziedzera), ir jāuzglabā formaldehīdā, lai saglabātu augstas kvalitātes RNS, īpaši ilgstošai uzglabāšanai.No žurku aknām ekstrahētā RNS būtībā tika noārdīta pēc vienas nedēļas uzglabāšanas ūdenī, savukārt no žurku liesas ekstrahētā RNS saglabājās stabila pēc 3 gadu uzglabāšanas ūdenī.Turklāt transkripti, kas garāki par 4 kb, ir jutīgāki pret degradāciju, ko izraisa RNāzes, nekā mazi transkripti.Lai palielinātu uzglabāto RNS paraugu stabilitāti, RNS var izšķīdināt dejonizētā formamīdā un uzglabāt -70°C.RNS konservēšanai izmantotajam formamīdam nedrīkst būt RNS noārdošu atkritumu.RNS no aizkuņģa dziedzera var uzglabāt formamīdā vismaz vienu gadu.Gatavojoties RNS lietošanai, RNS izgulsnēšanai varat izmantot šādu metodi: pievienojiet NaCl līdz 0,2 M un 4 reizes lielākam etanola tilpumam, novietojiet istabas temperatūrā 3-5 minūtes un centrifugējiet ar ātrumu 10 000 × g 5 minūtes.

2. Izmantojiet RNaseH-neaktīvo (RNaseH-) reverso transkriptāzi:

RNāzes inhibitorus bieži pievieno reversās transkripcijas reakcijām, lai palielinātu cDNS sintēzes ilgumu un iznākumu.RNāzes inhibitori jāpievieno pirmās virknes sintēzes reakcijas laikā buferšķīduma un reducējošā aģenta (piemēram, DTT) klātbūtnē, jo process pirms cDNS sintēzes denaturē inhibitoru, tādējādi atbrīvojot saistīto RNāzi, kas var noārdīt RNS.Olbaltumvielu RNāzes inhibitori tikai novērš RNS noārdīšanos ar RNāzi A, B, C un neaizkavē RNāzi uz ādas, tāpēc esiet piesardzīgs, lai neievadītu RNāzi no pirkstiem, neskatoties uz šo inhibitoru lietošanu.

Reversā transkriptāze katalizē RNS pārvēršanu par cDNS.Gan M-MLV, gan AMV papildus savai polimerāzes aktivitātei ir endogēna RNaseH aktivitāte.RNaseH aktivitāte un polimerāzes aktivitāte konkurē savā starpā par hibrīda virkni, kas veidojas starp RNS šablonu un DNS praimeru vai cDNS pagarinājuma virkni, un degradē RNS virkni RNS:DNS kompleksā.RNS veidne, ko noārda RNaseH aktivitāte, vairs nevar kalpot par efektīvu substrātu cDNS sintēzei, kas samazina cDNS sintēzes ražu un ilgumu.Tāpēc būtu lietderīgi novērst vai ievērojami samazināt reversās transkriptāzes RNaseH aktivitāti.

SuperScript Ⅱ reversā transkriptāze, RNaseH-MMLV reversā transkriptāze un thermoScript reversā transkriptāze, RNaseH-AMV, var iegūt lielāku daudzumu un vairāk pilna garuma cDNS nekā MMLV un AMV.RT-PCR jutību ietekmēs cDNS sintēzes daudzums.ThermoScript ir daudz jutīgāks nekā AMV.RT-PCR produktu izmēru ierobežo reversās transkriptāzes spēja sintezēt cDNS, īpaši, klonējot lielākas cDNS.Salīdzinot ar MMLV, SuperScripⅡ ievērojami palielināja garo RT-PCR produktu ražu.RNaseH-reversajai transkriptāzei ir arī paaugstināta termostabilitāte, tāpēc reakciju var veikt temperatūrā, kas ir augstāka par parasto 37-42 °C.Ieteiktajos sintēzes apstākļos izmantojiet oligo(dT) praimeri un 10 μCi [α-P]dCTP.Pirmās daļas kopējā raža tika aprēķināta, izmantojot TCA nokrišņu metodi.Pilna garuma cDNS tika analizēta, izmantojot pēc izmēra šķirotas joslas, kas tika izgrieztas un skaitītas uz sārmainās agarozes gēla.

3. Paaugstiniet inkubācijas temperatūru reversajai transkripcijai:

Augstāka inkubācijas temperatūra palīdz atvērt RNS sekundāro struktūru, palielinot reakcijas iznākumu.Lielākajai daļai RNS veidņu RNS un primeru inkubēšana 65 °C temperatūrā bez bufera vai sāls, kam seko ātra atdzesēšana uz ledus, likvidēs lielāko daļu sekundāro struktūru un ļaus primeriem saistīties.Tomēr dažām veidnēm joprojām ir sekundāras struktūras pat pēc termiskās denaturācijas.Šo sarežģīto veidņu pastiprināšanu var veikt, izmantojot ThermoScript Reverse Transcriptase un novietojot reversās transkripcijas reakciju augstākā temperatūrā, lai uzlabotu pastiprināšanu.Augstākas inkubācijas temperatūras var arī palielināt specifiskumu, īpaši, ja cDNS sintēzei izmanto gēnu specifiskos primerus (GSP) (sk. 3. nodaļu).Ja izmantojat GSP, pārliecinieties, ka primeru Tm ir tāds pats kā paredzamā inkubācijas temperatūra.Neizmantojiet oligo(dT) un random primerus temperatūrā virs 60°C.Nejaušiem primeriem nepieciešama inkubācija 25 ° C temperatūrā 10 minūtes pirms temperatūras paaugstināšanas līdz 60 ° C.Papildus augstākas reversās transkripcijas temperatūras izmantošanai specifiskumu var arī uzlabot, tieši pārnesot RNS/primera maisījumu no 65°C denaturācijas temperatūras uz reversās transkripcijas inkubācijas temperatūru un pievienojot iepriekš uzsildītu 2x reakcijas maisījumu (cDNS karstās palaišanas sintēze).Šī pieeja palīdz novērst starpmolekulāro bāzu pārī, kas notiek zemākā temperatūrā.Vairāku temperatūru pārslēgšanu, kas nepieciešama RT-PCR, var vienkāršot, izmantojot termisko ciklu.

Tth termostabila polimerāze darbojas kā DNS polimerāze Mg2+ klātbūtnē un kā RNS polimerāze Mn2+ klātbūtnē.To var turēt siltu līdz 65°C temperatūrai.Tomēr Mn2+ klātbūtne PCR laikā samazina precizitāti, kas padara Tth polimerāzi mazāk piemērotu augstas precizitātes amplifikācijai, piemēram, cDNS klonēšanai.Turklāt Tth ir zema reversās transkripcijas efektivitāte, kas samazina jutību, un, tā kā reverso transkripciju un PCR var veikt ar vienu fermentu, kontroles reakcijas bez reversās transkripcijas nevar izmantot, lai salīdzinātu cDNS amplifikācijas produktus ar piesārņojošu genoma DNS.Pastiprināšanas produkti tika atdalīti.

4. Piedevas, kas veicina reverso transkripciju:

Pirmās virknes sintēzes reakcijai tiek pievienotas piedevas, tostarp glicerīns un DMSO, kas var samazināt nukleīnskābes divkāršās virknes stabilitāti un atsaistīt RNS sekundāro struktūru.Var pievienot līdz 20% glicerīna vai 10% DMSO, neietekmējot SuperScript II vai MMLV aktivitāti.AMV var arī panest līdz 20% glicerīna, nezaudējot aktivitāti.Lai palielinātu RT-PCR jutību SuperScriptⅡ reversās transkripcijas reakcijā, var pievienot 10% glicerīna un inkubēt 45°C.Ja PCR pievieno 1/10 no reversās transkripcijas reakcijas produkta, tad glicerīna koncentrācija amplifikācijas reakcijā ir 0,4%, kas nav pietiekami, lai inhibētu PCR.

5. RNaseH ārstēšana:

cDNS sintēzes reakciju apstrāde ar RNaseH pirms PCR var palielināt jutību.Dažām veidnēm tiek uzskatīts, ka RNS cDNS sintēzes reakcijā novērš amplifikācijas produktu saistīšanos, un tādā gadījumā ārstēšana ar RNaseH var palielināt jutību.Parasti ārstēšana ar RNaseH ir nepieciešama, pastiprinot garākas pilna garuma cDNS mērķa veidnes, piemēram, mazkopiju bumbuļveida skerozi II.Šai sarežģītajai veidnei apstrāde ar RNaseH uzlaboja signālu, ko rada SuperScript II vai AMV sintezēta cDNS.Lielākajai daļai RT-PCR reakciju apstrāde ar RNaseH nav obligāta, jo PCR denaturēšanas solis 95 °C temperatūrā parasti hidrolizē RNS RNS:DNS kompleksā.

6. Mazo RNS noteikšanas metodes uzlabošana:

RT-PCR ir īpaši sarežģīta, ja ir pieejams tikai neliels RNS daudzums.Glikogēns, kas pievienots kā nesējs RNS izolācijas laikā, palīdz palielināt mazu paraugu ražu.RNāzes nesaturošu glikogēnu var pievienot vienlaikus ar Trizol pievienošanu.Glikogēns ir ūdenī šķīstošs, un to var turēt ūdens fāzē ar RNS, lai veicinātu turpmāko nogulsnēšanos.Paraugiem, kas ir mazāki par 50 mg audu vai 106 kultivētām šūnām, ieteicamā RNāzes nesaturošā glikogēna koncentrācija ir 250 μg/ml.

Acetilēta BSA pievienošana reversās transkripcijas reakcijai, izmantojot SuperScript II, var palielināt jutību, un maziem RNS daudzumiem, samazinot SuperScript II daudzumu un pievienojot 40 vienības RNaseOut nukleāzes inhibitora, var paaugstināt noteikšanas līmeni.Ja RNS izolācijas procesā tiek izmantots glikogēns, tad, izmantojot SuperScript II reversās transkripcijas reakcijai, joprojām ir ieteicams pievienot BSA vai RNāzes inhibitoru.

、Palieliniet RT-PCR specifiku

1. CND sintēze:

Pirmās virknes cDNS sintēzi var uzsākt, izmantojot trīs dažādas metodes, kuru relatīvā specifika ietekmē sintezētās cDNS daudzumu un veidu.

Izlases primer metode bija vismazāk specifiska no trim metodēm.Praimeri atkvēlina vairākās vietās visā transkriptā, radot īsas, daļēja garuma cDNS.Šo metodi bieži izmanto, lai iegūtu 5′ gala sekvences un iegūtu cDNS no RNS veidnēm ar sekundārās struktūras reģioniem vai beigu vietām, kuras nevar replicēt ar reverso transkriptāzi.Lai iegūtu garāko cDNS, katrā RNS paraugā empīriski jānosaka praimeru attiecība pret RNS.Izlases praimeru sākuma koncentrācija bija no 50 līdz 250 ng uz 20 μl reakciju.Tā kā cDNS, kas sintezēta no kopējās RNS, izmantojot nejaušus primerus, galvenokārt ir ribosomu RNS, poli(A)+RNS parasti izvēlas par veidni.

Oligo(dT) praimeri ir specifiskāki nekā nejaušie primeri.Tas hibridizējas ar poli(A) asti, kas atrodas vairuma eikariotu mRNS 3' galā.Tā kā poli(A)+ RNS ir aptuveni 1% līdz 2% no kopējās RNS, cDNS daudzums un sarežģītība ir daudz mazāka nekā ar nejaušiem primeriem.Tā augstās specifikas dēļ oligo(dT) parasti neprasa optimizēt RNS attiecību pret praimeriem un poli(A)+ atlasi.Ieteicams izmantot 0,5 μg oligo(dT) uz 20 μl reakcijas sistēmu.oligo(dT)12-18 ir piemērots lielākajai daļai RT-PCR.ThermoScript RT-PCR sistēma piedāvā oligo(dT)20, jo tai ir labāka termiskā stabilitāte augstākām inkubācijas temperatūrām.

Gēnu specifiskie primeri (GSP) ir visspecifiskākie primeri reversās transkripcijas posmam.GSP ir antisense oligonukleotīds, kas var specifiski hibridizēties ar RNS mērķa secību, atšķirībā no nejaušiem primeriem vai oligo (dT), kas savienojas ar visām RNS.Tie paši noteikumi, kas izmantoti PCR primeru projektēšanai, attiecas uz GSP projektēšanu reversās transkripcijas reakcijās.GSP var būt tāda pati secība kā amplifikācijas praimeris, kas tiek pievienots mRNS 3′-galākajam galam, vai arī GSP var būt paredzēts, lai atkvēlotu lejpus reversās amplifikācijas praimera.Dažiem amplificētiem subjektiem veiksmīgai RT-PCR ir jāizstrādā vairāk nekā viens antisense praimeri, jo mērķa RNS sekundārā struktūra var novērst praimera saistīšanos.20 μl pirmās virknes sintēzes reakcijā ieteicams izmantot 1 pmol antisense GSP.

2. Paaugstiniet inkubācijas temperatūru reversajai transkripcijai:

Lai pilnībā izmantotu visas VPS specifikas priekšrocības, jāizmanto reversā transkriptāze ar augstāku termostabilitāti.Termostabilās reversās transkriptāzes var inkubēt augstākā temperatūrā, lai palielinātu reakcijas stingrību.Piemēram, ja GSP atlaidina 55 ° C temperatūrā, GSP specifika netiks pilnībā izmantota, ja reversajai transkripcijai izmanto AMV vai M-MLV ar zemu stingrību 37 ° C.Tomēr SuperScript II un ThermoScript var reaģēt 50°C vai augstākā temperatūrā, kas novērsīs nespecifiskus produktus, kas rodas zemākā temperatūrā.Lai nodrošinātu maksimālu specifiskumu, RNS/praimeru maisījumu var pārnest tieši no 65°C denaturācijas temperatūras uz reversās transkripcijas inkubācijas temperatūru un pievienot iepriekš uzsildītam 2x reakcijas maisījumam (cDNS sintēzes karstā palaišana).Tas palīdz novērst starpmolekulāro bāzu pārošanos zemās temperatūrās.Vairākas temperatūras pārejas, kas nepieciešamas RT-PCR, var vienkāršot, izmantojot termisko ciklu.

3. Samazina genoma DNS piesārņojumu:

Iespējamās grūtības, ar kurām saskaras RT-PCR, ir genoma DNS piesārņojums RNS.Izmantojot labu RNS izolēšanas metodi, piemēram, Trizol Reagent, samazināsies genoma DNS daudzums, kas piesārņo RNS preparātu.Lai izvairītos no produktiem, kas iegūti no genoma DNS, RNS var apstrādāt ar amplifikācijas pakāpes DNāzi I, lai pirms reversās transkripcijas noņemtu piesārņojošo DNS.DNāzes I gremošana tika pārtraukta, paraugus inkubējot 2, 0 mM EDTA 10 minūtes 65 ° C temperatūrā.EDTA var helātus veidot magnija jonus, novēršot no magnija jonu atkarīgo RNS hidrolīzi augstās temperatūrās.

Lai atdalītu pastiprināto cDNS no piesārņojošiem genoma DNS amplifikācijas produktiem, var izveidot primerus, kas katrs tiek savienots ar atsevišķiem eksoniem.PCR produkti, kas iegūti no cDNS, būs īsāki nekā tie, kas iegūti no piesārņotas genoma DNS.Turklāt katram RNS šablonam tika veikts kontroles eksperiments bez reversās transkripcijas, lai noteiktu, vai konkrētais fragments ir iegūts no genoma DNS vai cDNS.PCR produkts, kas iegūts bez reversās transkripcijas, ir iegūts no genoma.