• facebook
  • linkedin
  • youtube

Nesen es atklāju kaut ko pārsteidzošu!Daudzi pieredzējuši eksperimentu profesionāļi ap viņu pat nezina dažus ļoti vienkāršus eksperimentālo zināšanu punktus.

Piemēram, vai varat atbildēt uz šādiem jautājumiem?

Vai ir atšķirība starp OD260 un A260?Ko nozīmē katrs?
OD ir optiskā blīvuma (optiskā blīvuma) saīsinājums, A ir absorbcijas (absorbcijas) saīsinājums, abi jēdzieni faktiski ir vienādi, “optiskais blīvums” ir “absorbcija”, bet “optiskais blīvums” atbilst lielākajai daļai valsts standartu un ir vairāk standartizēts.

Parasti mēs mēra OD vērtību pie 260 nm, lai aprēķinātu nukleīnskābes koncentrāciju, ko tad nozīmē 1OD?
Nukleīnskābei ir maksimālais absorbcijas maksimums pie viļņa garuma 260 nm, kas satur gan DNS, gan RNS, kā arī fragmentētus nukleīnskābes fragmentus (tas ir galvenais).
OD vērtība, kas izmērīta pie viļņa garuma 260 nm, tika reģistrēta kā OD260.Ja paraugs ir tīrs, OD260 vērtība var aprēķināt nukleīnskābes parauga koncentrāciju.
1 OD260 = 50 μg/ml dsDNS (divpavedienu DNS)
=37 μg/ml ssDNS (vienpavedienu DNS)
=40 μg/ml RNS
=30 μg/ml dNTP (oligonukleotīdi)
Vai ir kāds savienojums un atšķirība starp RT-PCR, Realtime-PCR un QPCR?
RT-PCR ir saīsinājums no reversās transkripcijas PCR
Real Time PCR = qPCR, saīsinājums no Quantitative Real Time PCR
Lai gan šķiet, ka reālā laika PCR (reālā laika fluorescējošā kvantitatīvā PCR) un reversās transkripcijas PCR (reversās transkripcijas PCR) ir saīsināti kā RT-PCR.Bet starptautiskā konvencija ir šāda: RT-PCR īpaši attiecas uz reversās transkripcijas PCR.

Kādi ir parasti izmantotie nt, bp un kb, lai aprakstītu DNS/RNS garumu bioloģijā?
nt = nukleotīds
bp = bāzes pāris bāzes pāris
kb = kilobāze

Protams, jūs varētu teikt, ka daudziem cilvēkiem šīs sīkās detaļas ir vienalga!Ikviens to dara, un neviens jums nejautās, kas tas ir.Jūs zināt, ka tas ir nevajadzīgi, vai ne?

Nē, nē, nē, tas ir ļoti svarīgi zināt!kuru dēļ?
Jo jūs vēlaties ievietot rakstu!Brālis!Neatkarīgi no tā, vai vēlaties iegūt absolvēšanu vai zinātniskās pētniecības sasniegumus, jums jāpaļaujas uz rakstiem, lai runātu!

Nukleīnskābes ekstrakcijai vajadzētu būt visvienkāršākajam un visvienkāršākajam eksperimentam.Nukleīnskābju ekstrakcijas kvalitāte tieši nosaka turpmāko eksperimentu rezultātus.

Lai gan esmu to teicis daudzas reizes, joprojām ir daudz draugu, kuriem ir vienalga.Šoreiz nolēmu izkļūt no raksta!

attēls1
Minimālā informācija kvantitatīvo reāllaika PCR eksperimentu publicēšanai, saukta par MIQE, ir starptautiski uzsāktu fluorescences kvantitatīvo eksperimentu vadlīniju kopums, kas piedāvā minimālos standartus eksperimentālajai informācijai, kas nepieciešama fluorescences kvantitatīvo PCR eksperimentu novērtēšanai un rakstu publicēšanai.Izmantojot eksperimentētāja piedāvātos eksperimentālos apstākļus un analīzes metodes, recenzenti var labāk novērtēt pētnieka eksperimentālās shēmas derīgumu.
attēls2
Var redzēt, ka nukleīnskābju ekstrakcijas sadaļā ir ierosināti šādi noteikšanas vienumi:

“E” norāda informāciju, kas jāsniedz, un “D” norāda informāciju, kas jāsniedz, ja nepieciešams.

Forma ir ļoti sarežģīta, patiesībā es gribu teikt, ka ikvienam ir jāsāk no

tīrība (D), raža (D), integritāte (E) un konsistence (E), lai novērtētu nukleīnskābes šajos četros aspektos.

Saskaņā ar eksperimentēšanas paradumiem vispirms runājiet par tīrības un koncentrācijas novērtēšanas metodēm.

OD mērīšana ir eksperimentētāju iecienītākā un vienkāršākā noteikšanas metode.Runājot par principu, es šeit neiedziļināšos.Daudzas laboratorijas tagad izmanto ultra-mikro spektrofotometrus, lai tieši kvantitatīvi analizētu nukleīnskābju paraugus.Parādot absorbcijas vērtību, programma tieši norāda koncentrācijas vērtību (nukleīnskābi, olbaltumvielas un fluorescējošu krāsu) un saistītās attiecības.Kas attiecas uz OD vērtības analīzi, saglabājiet šo attēlu, un viss būs kārtībā.

Universāls OD vērtību risinājumu saraksts

attēls3Tomēr ir daži brīdinājumi, kas jums ir jāizceļ atsevišķi.

(Galu galā es zinu, ka jums ir jābūt tiem, kas uzkrāj un gaida, līdz tie būs nepieciešami!)

1. piezīme. Aprīkojums

OD vērtību ietekmēs dažādas iekārtas.Kamēr OD260 ir noteiktā diapazonā, OD230 un OD280 vērtībām ir nozīme.Piemēram, parastā Eppendorf D30 absorbcijas diapazons pie 260 nm ir 0 ~ 3 A, un NanoDrop One of Thermo ir 260 nm.Absorbcijas diapazons 0,5–62,5 A.

2. piezīmeAtšķaidīšanas reaģents

OD vērtību var ietekmēt dažādu reaģentu atšķaidīšana.Piemēram, attīrītas RNS OD260/280 nolasījums pH7,5 10 mM Trisbuferis ir no 1,9 līdz 2,1, kamēr iekšāneitrāls ūdens šķīdumsattiecība būs mazāka, varbūt tikai 1,8-2,0, bet tas nenozīmē, ka mainās RNS kvalitāte Atšķirība.

3. piezīmeAtlikušās vielas

Atliekvielu esamība ietekmēs nukleīnskābju koncentrācijas mērīšanas precizitāti, tāpēc ir nepieciešams pēc iespējas izvairīties no olbaltumvielu, fenola, polisaharīdu un polifenola atliekām nukleīnskābju paraugos.

Tomēr patiesībā ekstrakcija ar organiskiem reaģentiem ir veca metode.Komerciālajos komplektos ekstrakcijas efektu var panākt, izmantojot adsorbcijas kolonnu uz silīcija dioksīda bāzes kombinācijā ar centrifugēšanu, izvairoties no toksiskiem un kaitīgiem organiskiem reaģentiem, kurus ir grūti noņemt utt. Problēma, piemēram,Foregene nukleīnskābju ekstrakcijas komplekts, visas darbības laikā neizmanto DNāzi/RNāzi un toksiskus organiskos reaģentus, ātri un droši, unefekts irlabi(nejauši pateica, ka plikpauris, bet zinu, ka gribi zināt).

1. piemērs: genoma DNS ekstrakcijas iznākums un tīrība

Foregene augsnes DNS izolācijas komplekts (DE-05511) apstrādā augsnes paraugus no dažādiem avotiem, un iegūtās genoma DNS daudzums un tīrība ir parādīta šajā tabulā:
attēls42. piemērs: Audu RNS ekstrakcijas iznākums un tīrība

Dzīvnieku kopējās RNS izolācijas komplekts (RE-03012) apstrādāja dažādus audu paraugus, un iegūtās RNS daudzums un tīrība ir parādīta zemāk esošajā tabulā (peļu audiem):
attēls5Tomēr nedomājiet, ka esat pabeidzis ar OD vērtību.Vai jūs parūpējaties par galvenajiem punktiem, kurus es jums uzzīmēju priekšā?

Paziņojums

Absorbcijā tiks aprēķinātas arī sadrumstalotās nukleīnskābju molekulas.Pieņemot, ka jums ir genoma DNS atlikumi RNS, jūsu OD vērtība, šķiet, ir ļoti augsta, bet faktisko RNS koncentrāciju nevar noteikt.Vai ir jūsu RNS Nav skaidrs, vai ir noārdīšanās, tāpēc mums joprojām ir nepieciešama visaptveroša novērtēšanas metode, lai sniegtu precīzāku spriedumu, tas ir, MIQE minētais nukleīnskābju integritātes novērtējums.


Izlikšanas laiks: 13. janvāris 2022. gada laikā