Padomi līmes atgūšanas uzlabošanai

1. Elektroforēzes laikā palieliniet parauga slodzi.

2. Izmantojiet svaigi pagatavotu elektroforēzes buferšķīdumu.

3. Griežot līmi, mēģiniet griezt tikai līmi ar sloksnēm, lai samazinātu līmes griešanas apjomu: nav nepieciešama līme ar dažiem fragmentiem, pretējā gadījumā tas ietekmēs atgūšanas ātrumu.

4. Pēc divu vai vairāku līmes gabalu izkausēšanas izmantojiet cauruli neatkarīgi no tilpuma un pārnesiet to uz to pašu kolonnu.

5. Solā pievienotā šķīduma var būt nedaudz vairāk, kas vairāk veicina DNS saistīšanos ar membrānu, bet parasti nepārsniedz 750ul.

6. Gēla atgūšanas atslēga ir DNS saistīšana ar kolonnu, izmantojot kolonnā esošā šķīduma sāls koncentrāciju, skābumu (lādiņu) un hidrofobitāti.Tāpēc, ja elektroforēzes buferšķīduma pH ir pārāk augsts, zolam var pievienot 10ul (pH 5,0, 3mol/L NaAC);lai labāk pārtvertu DNS molekulas uz membrānas, pēc līmes izšķīdināšanas šķidrumā var pievienot 30% izopropanola, kas uzkarsē.

7. Pirms eluenta pievienošanas atstājiet kolonnu istabas temperatūrā dažas minūtes (apmēram 10 minūtes), lai pilnībā iztvaikotu etanolu.

8. Visbeidzot pievienojiet mazāk eluenta, lai samazinātu reģenerācijas apjomu.Parasti eluēšanai izmanto 30-50μl eluentu (ne pārāk maz, pretējā gadījumā tas nespēs samitrināt membrānu, kas neveicina eluēšanu);eluēšanas pilieni atrodas membrānas centrā, lai pilnībā eluētu ar membrānu saistīto DNS.

9. Pēc eluenta pievienošanas to var eluēt 55 grādu ūdens vannā uz 5 minūtēm vai ievietot 50 grādu ūdens vannā ilgāk par 10 minūtēm, vai aiztaisīt ar parafilmu 4 grādos uz nakti, un pēc tam centrifugēt, lai nākamajā dienā atgūtu, efekts ir labs.

10. Pievienojiet centrifugēto eluātu atpakaļ adsorbcijas kolonnai un centrifugējiet vēlreiz.

Detalizētas metodes un procedūras PCR produktu atgūšanai

1. Parastā gumijas pārstrāde

Ja vēlaties atgūt līmi, vislabāk ir izmantot komplektu, kas ir ērts un kuram ir nedaudz augstāks atgūšanas ātrums.Ja jums patiešām ir nepieciešams to manuāli atgūt, pēc līmes izgriešanas varat pievienot TE tilpumu 3 reizes.Pēc kausēšanas ūdens vannā fenolu, fenolu/hloroformu tīri ekstrahē un nogulsnē etanolu.Tieši tā.

2. DNS atgūšana no gēliem ar zemu kušanas temperatūru

DNS fragmentu attīrīšana Pievieno TE (10 mmol/l Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mmol/l EDTA), kas vienāds ar gēla tilpumu, un ievieto 65°C ūdens vannā uz 5 minūtēm, lai pilnībā izšķīdinātu želeju.

Pēc tam, kad tas tika sasildīts līdz istabas temperatūrai, tika pievienots vienāds daudzums fenola (piesātināts ar TE, TE tika noslēgts augšējā slānī un tika noņemts apakšējais fenola slānis), un maisījumu viegli samaisa (nav nepieciešama maisīšana) un centrifugēja ar ātrumu 12 000 apgr./min 3 minūtes.Atkārtojiet 1-2 reizes.

Paņemiet supernatantu, pievienojiet 0,1 tilpumu 3 mol/l nātrija acetāta (pH 5,2) un 2,5 reizes lielāku absolūtā etanola tilpumu, lai veiktu etanola izgulsnēšanu.Attīrīto DNS izšķīdina ar atbilstošu TE daudzumu, izmēra saturu un sagatavo lietošanai (to var izmantot mērķa gēnu struktūras analīzei, zondes sagatavošanai utt.).

3. PCR atgūšana ar labu amplifikācijas specifiku

Ja PCR amplifikācijas specifika ir laba, tā ir tikai vienkārša PCR produkta attīrīšana un atgūšana.PCR produktam var pievienot 50 ug/ml proteināzi K, 37 grādus 1 stundu, vienu reizi ekstrahēt ar fenolu/hloroformu, vienu reizi ekstrahēt ar hloroformu un pievienot 0,1 tilpumu supernatanta.Nātrija acetāts tika iegūts, izgulsnējot ar 2,5 tilpumiem absolūtā etanola.

Saistītie produkti:

https://www.foreivd.com/pcr-purification-kit-2-product/

https://www.foreivd.com/blood-superdirecttm-pcr-kit-edta-product/