• facebook
  • linkedin
  • youtube

Tradicionālās reversās transkriptāzes nevar izturēt augstu temperatūru (optimālā temperatūra MMLV aktivitātei ir 37-50 °C, un AMV ir 42-60 °C).Sarežģītāku vīrusu RNS nevar efektīvi reversā transkribēt par cDNS zemā temperatūrā, kā rezultātā noteikšanas efektivitāte Samazinājums.Tradicionālā RT-qPCR parasti prasa divu galveno enzīmu (reversās transkriptāzes un DNS polimerāzes) līdzdalību, kas neļauj vienkāršot reakcijas sistēmas darbību un samazināt izmaksas.Šeit mēs iepazīstināsim ar divām augstas temperatūras izturīgas reversās transkriptāzes, TtH un RevTaq.Šiem diviem fermentiem ir arī DNS polimerāzes funkcija, tāpēc tos sauc par bifunkcionāliem enzīmiem.

TtH DNS polimerāze

Noteikti esat dzirdējuši par TtH, kas iegūts no termofīlās baktērijas Thermus thermophilus HB8.Divvērtīgu katjonu, piemēram, Mg2+, klātbūtnē tam ir DNS polimerāzes aktivitāte.To plaši izmanto PCR reakcijās, piemēram, Taq enzīmā, taču tam ir augstāka karstumizturība nekā Taq enzīmam, tāpēc tam ir arī labāka ietekme uz PCR ar augsta GC satura veidnēm.

· Šim fermentam būtībā nav 3′→5′ eksonukleāzes aktivitātes un 5′→3′ eksonukleāzes aktivitātes, tāpēc to var izmantot arī dideoksi sekvencēšanai.

· Šim fermentam ir RTāzes aktivitāte.Mn2+ klātbūtnē tiks pastiprināta RTāzes aktivitāte.Izmantojot šo funkciju, to var izmantot, lai veiktu reversās transkripcijas reakciju un PCR reakciju vienā mēģenē, tas ir, vienpakāpes RT-PCR.Tomēr Mn2+ klātbūtnē RT-PCR precizitāte nav augsta.RT aktivitātei nav nekāda sakara ar rnāzes H aktivitāti.

· Paaugstināta Tth-DNS polimerāzes aktivitāte (pH9, optimālais +55℃~+70℃, maksimums +95℃) pārvar RNS sekundārās struktūras radītās problēmas.Iegūto cDNS var pastiprināt ar PCR ar to pašu fermentu Mg2+ jonu klātbūtnē.

· Tth-DNS polimerāzes spēja veikt reverso transkripciju un DNS amplifikāciju augstās temperatūrās padara šo enzīmu noderīgu kvantitatīvās RT-PCR, klonēšanas un gēnu ekspresijas analīzēs šūnu un vīrusu RNS.
· Tth-DNS polimerāzi izmanto RT-PCR, lai pastiprinātu RNS līdz 1 kb.

null
 

Īpašības un priekšrocības

Tth DNS polimerāze:

• Nodrošiniet optimizētu polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR) produkta izmēru, vismaz 1000 bp RT-PCR reakcijā

• Kā substrātu pieņemt modificētu dezoksiribonukleozīda trifosfātu

• Nav saistīts ar RNāzes H aktivitāti

• Ir augsta termiskā stabilitāte, lai pārvarētu problēmas, kas parasti saistītas ar RNS augsto sekundāro struktūru

RevTaq RT-PCR DNS polimerāze

Karstumizturīga DNS polimerāze ar reversās transkriptāzes aktivitāti

RevTaq-RT-PCR-DNS polimerāze ir konstruēts, ļoti karstumizturīgs, divfunkcionāls enzīms ar reversās transkriptāzes un DNS polimerāzes aktivitātēm, kas iegūtas virzītas un mākslīgas evolūcijas rezultātā.

· RevTaq RT-PCR DNS polimerāzes pusperiods 95°C temperatūrā ir lielāks par 40 minūtēm.

· RevTaq RT-PCR DNS polimerāze nodrošina augstas temperatūras reverso transkripciju tieši no RNS veidnes, un reversās transkripcijas soli var atkārtot vairākas reizes, lai radītu vairāk cDNS veidņu.

· RevTaq RT-PCR DNS polimerāze pieļauj “nulles soļa” RT-PCR (nav izotermiskās reversās transkripcijas stadijas), jo cikliskā PCR pagarinājuma solī reversā transkripcija un DNS amplifikācija notiek vienlaicīgi.Tas arī veicina reversās transkripcijas reakciju augstās temperatūrās, tādējādi samazinot problēmas, kas rodas, kausējot RNS spēcīgo sekundāro struktūru augstās temperatūrās.

· Pateicoties karstās palaišanas formulai, kuras pamatā ir aptamērs, RevTaq RT-PCR DNS polimerāze sniegs labākus rezultātus, ja atkausēšanas un pagarināšanas temperatūra ir augstāka par 57°C.

· Tā kā enzīms ir karstumizturīgs, ieteicams veidot gruntējumus un zondes ar ļoti augstu kušanas temperatūru (>60°C).

· Reakcijas iestatīšanas procesā ir ieteicams optimizēt atlaidināšanas/pagarināšanas posma temperatūru, izmantojot temperatūras gradientu.

· Jo augstāka temperatūra, jo augstāka ir PCR specifika.Reversās transkripcijas ciklu parasti veic augstākā temperatūrā nekā PCR ciklu, jo DNS Primer:RNA Template hibridizācijai parasti ir augstāka kušanas temperatūra nekā DNS Primer:cDNS Template dupleksam.

· RevTaq RT-PCR DNS polimerāze ir ģenētiski izstrādāta un optimizēta, un amplikona izmērs ir no 60 līdz 300 bp.

RevTaq RT-PCR DNS polimerāzes noteikšanas robeža sasniedz 4 kopijas/Divi (2)

Optimizētā reakcijas sistēma (augstas kušanas temperatūras primeru izveide) ir parādīta attēlā.RevTaq RT-PCR DNS polimerāzes vadītais RT-PCR uzrāda labāku jutību nekā TaqPath 1-pakāpes RT-qPCR galvenais maisījums un zemāku noteikšanas parauga atšķaidīšanas gradientu.

Vairāk priekšrocību:

Ātrās palaišanas funkcija → Sākotnējo termiskās denaturēšanas soli var izlaist.

Karstās palaišanas aptamera formula → Nekavējoties nodrošina 100% enzīmu aktivitāti un novērš nespecifisku pastiprināšanos zemā temperatūrā (<57°C).

Šķelšanas funkcija → RNS ekstrakcijas solis tiek izlaists, jo RevTaq RT-PCR DNS polimerāze var apstrādāt arī neapstrādātus reakcijas paraugus.Tas var nekavējoties iznīcināt eikariotu, baktēriju un vīrusu šūnu membrānas karstā RT-PCR ciklā.

IVD izejvielu līmenis → augsti kvalitātes standarti un ārkārtīgi konkurētspējīgas cenas


Publicēšanas laiks: 12. augusts 2021