Izejmateriāls: RNS
Kvantitatīvā reversās transkripcijas PCR (RT-qPCR) ir eksperimentāla metode, ko izmanto PCR eksperimentos, izmantojot RNS kā izejmateriālu.Izmantojot šo metodi, kopējā RNS vai ziņojuma RNS (mRNS) vispirms tiek transkribēta komplementārā DNS (cDNS) ar reversās transkriptāzes palīdzību.Pēc tam tika veikta qPCR reakcija, izmantojot cDNS kā veidni.RT-qPCR ir izmantots dažādos molekulārās bioloģijas lietojumos, tostarp gēnu ekspresijas analīzē, RNS traucējumu validācijā, mikroarray validācijā, patogēnu noteikšanā, ģenētiskajā testēšanā un slimību izpētē.
Vienpakāpes un divpakāpju metodes RT-qPCR
RT-qPCR var veikt ar vienpakāpju vai divpakāpju metodi.Vienpakāpes RT-qPCR apvieno reverso transkripciju un PCR amplifikāciju, ļaujot reversajai transkriptāzei un DNS polimerāzei pabeigt reakciju tajā pašā mēģenē tādos pašos bufera apstākļos.Vienpakāpes RT-qPCR prasa izmantot tikai secībai raksturīgus primerus.Divpakāpju RT-qPCR reversā transkripcija un PCR amplifikācija tiek veikta divās mēģenēs, izmantojot dažādus optimizētus buferus, reakcijas apstākļus un praimeru dizaina stratēģijas.
| Priekšrocība | Trūkums | |
| Viens solis | Šai metodei ir mazāk eksperimentālo kļūdu, jo abas reakcijas tiek veiktas vienā mēģenē
Mazāks pipetēšanas soļu skaits samazina piesārņojuma risku
Piemērots augstas caurlaidības pastiprināšanai/skrīningam, ātrai un reproducējamai | Divpakāpju reakcijas nevar optimizēt atsevišķi
Tā kā reakcijas apstākļi tiek apdraudēti, apvienojot divpakāpju reakciju, jutība nav tik laba kā divpakāpju metodei.
Viena parauga atklāto mērķu skaits ir neliels |
| Divi soļi | Spēja izveidot stabilas cDNS bibliotēkas, kuras var uzglabāt ilgu laiku un izmantot vairākās reakcijās
Mērķa gēnus un atsauces gēnus var pastiprināt no vienas un tās pašas cDNS bibliotēkas, neizmantojot vairākas cDNS bibliotēkas
Reakcijas buferi un reakcijas apstākļi, kas ļauj optimizēt atsevišķas reakcijas
Elastīga sprūda nosacījumu izvēle | Izmantojot vairākas caurules un vairāk pipetes soļu, palielinās DNS piesārņojuma risks, un laikietilpīga.
Nepieciešama lielāka optimizācija nekā vienpakāpes metode |
Saistītie produkti:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-SYBR Green I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Viens solis)-Taqman
RT Easyᵀᴹ I Master premikss pirmās kārtas CDNS sintēzei
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Kopējās RNS un mRNS atlase
Izstrādājot RT-qPCR eksperimentu, ir svarīgi izlemt, vai reversās transkripcijas veidnei izmantot kopējo RNS vai attīrītu mRNS.Lai gan mRNS var nodrošināt nedaudz lielāku jutību, kopējā RNS joprojām tiek bieži izmantota.Iemesls tam ir tāds, ka kopējai RNS kā izejmateriālam ir svarīgāka priekšrocība nekā mRNS.Pirmkārt, procesam ir nepieciešams mazāk attīrīšanas posmu, kas nodrošina labāku veidnes kvantitatīvo atgūšanu un labāku rezultātu normalizēšanu uz sākuma šūnu skaitu.Otrkārt, tas izvairās no mRNS bagātināšanas posma, kas var izvairīties no izkropļotu rezultātu iespējamības dažādu mRNS atšķirīgās atkopšanas dēļ.Kopumā, tā kā lielākajā daļā lietojumu mērķa gēna relatīvā kvantitatīvā noteikšana ir svarīgāka par noteikšanas absolūto jutību, vairumā gadījumu kopējā RNS ir piemērotāka.
Reversās transkripcijas primer
Divpakāpju metodē cDNS reakcijas ievadīšanai var izmantot trīs dažādas metodes: oligo(dT) praimerus, nejaušus primerus vai secībai specifiskus praimerus.Parasti oligo(dT) primerus un izlases primerus izmanto kombinācijā.Šie praimeri pievienojas veidnes mRNS virknei un nodrošina reverso transkriptāzi ar sākumpunktu sintēzei.
| Gruntskrāsas izvēle | Struktūra un funkcija | Priekšrocība | Trūkums |
| Oligo(dT) grunts (vai noenkurots oligo(dT) gruntējums) | Pagarināta atkausēšana ar timīna atlikumiem mRNS poli(A) astē;enkura oligo (dT) primer satur G, C vai A 3′ galā (enkura vieta) | Pilna garuma cDNS sintēze no poli(A) astes mRNS
Piemērojams, ja ir pieejams mazāk izejmateriālu
Piestiprināšanas vieta nodrošina, ka oligo(dT) primer saistās ar mRNS 5′ poli(A) asti | Piemērots tikai gēnu pastiprināšanai ar poli(A) astēm
Iegūstiet cDNS, kas ir atdalīta no primārās vietas*2 poli(A)
Novirzīts, lai saistītu ar 3′ galu*
*Šī iespēja tiek samazināta līdz minimumam, ja tiek izmantoti noenkuroti oligo(dT) grunti |
| izlases grunts
| 6 līdz 9 bāzes garumā, kas RNS transkripcijas laikā var pievienoties vairākām vietām | Pievienot visām RNS (tRNS, rRNS un mRNS)
Piemērots transkriptiem ar nozīmīgu sekundāro struktūru vai gadījumos, kad ir pieejams mazāk izejmateriālu
Augsta cDNS ienesīgums | cDNS tiek reversi transkribēta no visas RNS, kas parasti nav vēlama un var atšķaidīt mērķa mRNS signālu
iegūt saīsinātu cDNS |
| secībai specifiski praimeri | Pielāgoti primeri, kuru mērķauditorija ir noteiktas mRNS sekvences | specifiska cDNS bibliotēka
Uzlabot jutību
Izmantojot reversos qPCR primerus | Aprobežojas tikai ar viena mērķa gēna sintēzi |
Reversā transkriptāze
Reversā transkriptāze ir enzīms, kas izmanto RNS, lai sintezētu DNS.Dažām reversajām transkriptāzēm ir RNāzes aktivitāte, un tās pēc transkripcijas var noārdīt RNS virknes RNS-DNS hibrīda virknēs.Ja tai nav RNāzes fermentatīvās aktivitātes, RNaseH var pievienot augstākai qPCR efektivitātei.Parasti izmantotie enzīmi ietver Moloney peles leikēmijas vīrusa reverso transkriptāzi un putnu mieloblastomas vīrusa reverso transkriptāzi.RT-qPCR ir ideāli izvēlēties reverso transkriptāzi ar augstāku termostabilitāti, lai cDNS sintēzi varētu veikt augstākās temperatūrās, nodrošinot veiksmīgu RNS ar augstāku sekundāro struktūru transkripciju, vienlaikus saglabājot to pilnu aktivitāti visā reakcijas laikā, kā rezultātā cDNS iznākums ir lielāks.
Saistītie produkti:
Foreasy M-MLV reversā transkriptāze
Reversās transkriptāzes RNāzes H aktivitāte
RNaseH spēj noārdīt RNS virknes no RNS-DNS dupleksiem, nodrošinot efektīvu divpavedienu DNS sintēzi.Tomēr, izmantojot garo mRNS kā veidni, RNS var priekšlaicīgi noārdīties, izraisot saīsinātu cDNS.Tāpēc bieži vien ir lietderīgi samazināt RNaseH aktivitāti cDNS klonēšanas laikā, ja ir vēlama garu transkriptu sintēze.Turpretim reversās transkriptāzes ar RNāzes H aktivitāti bieži ir labvēlīgas qPCR lietojumiem, jo tās uzlabo RNS-DNS dupleksu kušanu pirmajā PCR ciklā.
Grunts dizains
PCR primeriem, ko izmanto qPCR posmam RT-qPCR, ideālā gadījumā vajadzētu būt veidotiem tā, lai tie aptvertu eksona-eksona savienojumu, kur amplifikācijas praimeri potenciāli varētu aptvert faktisko eksona-intronu robežu.Tā kā intronu saturošās genoma DNS sekvences netiek pastiprinātas, šis dizains samazina viltus pozitīvu rezultātu pastiprināšanas risku, piesārņojot genoma DNS.
Ja primerus nevar izveidot, lai atdalītu eksonus vai eksonu un eksonu robežas, var būt nepieciešams apstrādāt RNS paraugus ar RNāzes nesaturošu DNāzi I vai dsDNāzi, lai noņemtu genoma DNS piesārņojumu.
RT-qPCR kontrole
Visos RT-qPCR eksperimentos jāiekļauj reversās transkripcijas negatīvā kontrole (-RT kontrole), lai noteiktu DNS piesārņojumu (piemēram, genoma DNS vai PCR produktus no iepriekšējām reakcijām).Šajā kontrolē ir visi reakcijas komponenti, izņemot reverso transkriptāzi.Tā kā ar šo kontroli nenotiek reversā transkripcija, ja tiek novērota PCR amplifikācija, visticamāk, ir inficēšanās ar DNS.
Izlikšanas laiks: Aug-02-2022
