Nav pastiprināšanas signālu

1. Komplektā esošā Taq DNS polimerāze zaudē savu aktivitāti nepareizas uzglabāšanas vai komplekta derīguma termiņa beigām.
Ieteikums: Apstipriniet komplekta uzglabāšanas nosacījumus;atkārtoti pievienojiet atbilstošu Taq DNS polimerāzes daudzumu PCR sistēmai vai iegādājieties jaunu reāllaika PCR komplektu saistītajiem eksperimentiem.

2.DNS veidnē ir daudz Taq DNS polimerāzes inhibitoru.
Ieteikums: atkārtoti attīriet veidni vai samaziniet izmantotās veidnes daudzumu.

3. Mg2+ koncentrācija nav piemērota.
Ieteikums: Mg2+ koncentrācija mūsu nodrošinātajā 2× Real PCR Mix ir 3,5 mM.Tomēr dažiem īpašiem primeriem un veidnēm Mg2+ koncentrācija var būt augstāka.Tāpēc jūs varat tieši pievienot MgCl2, lai optimizētu Mg2+ koncentrāciju.Optimizēšanai ieteicams katru reizi palielināt Mg2+ 0,5 mM.

4. PCR amplifikācijas apstākļi nav piemēroti, un praimera secība vai koncentrācija ir nepareiza.
Ieteikums: apstipriniet praimeru secības pareizību un primer nav degradējies;ja pastiprināšanas signāls nav labs, mēģiniet pazemināt atkausēšanas temperatūru un atbilstoši noregulējiet primer koncentrāciju.

5. Veidnes daudzums ir pārāk mazs vai pārāk daudz.
Ieteikums: veiciet veidnes linearizācijas gradienta atšķaidīšanu un atlasiet veidnes koncentrāciju ar labāko PCR efektu reāllaika PCR eksperimentam.

NTC ir pārāk augsta fluorescences vērtība

1. Darbības laikā radies reaģenta piesārņojums.
Ieteikums: nomainiet ar jauniem reaģentiem reāllaika PCR eksperimentiem.

2.Piesārņojums notika PCR reakcijas sistēmas sagatavošanas laikā.
Ieteikums: Darbības laikā veiciet nepieciešamos aizsardzības pasākumus, piemēram: valkājiet lateksa cimdus, izmantojiet pipetes galu ar filtru utt.

3. Praimeri ir degradēti, un to degradācija izraisīs nespecifisku pastiprināšanos.
Ieteikums: izmantojiet SDS-PAGE elektroforēzi, lai noteiktu, vai primeri ir bojāti, un aizstājiet tos ar jauniem primeriem reāllaika PCR eksperimentiem.

Praimera dimērs vai nespecifiska amplifikācija

1.Mg2+ koncentrācija nav piemērota.
Ieteikums: Mūsu piedāvātā 2× Real PCR EasyTM Mix Mg2+ koncentrācija ir 3,5 mM.Tomēr dažiem īpašiem primeriem un veidnēm Mg2+ koncentrācija var būt augstāka.Tāpēc jūs varat tieši pievienot MgCl2, lai optimizētu Mg2+ koncentrāciju.Optimizēšanai ieteicams katru reizi palielināt Mg2+ 0,5 mM.

2. PCR atkausēšanas temperatūra ir pārāk zema.
Ieteikums: katru reizi palieliniet PCR atkausēšanas temperatūru par 1 ℃ vai 2 ℃.

3. PCR produkts ir pārāk garš.
Ieteikums: reāllaika PCR produkta garumam jābūt no 100 līdz 150 bp, ne vairāk kā 500 bp.

4. Praimeri ir noārdījušies, un to degradācija izraisīs specifiskas pastiprināšanas parādīšanos.
Ieteikums: izmantojiet SDS-PAGE elektroforēzi, lai noteiktu, vai primeri ir bojāti, un aizstājiet tos ar jauniem primeriem reāllaika PCR eksperimentiem.

5. PCR sistēma ir nepareiza vai sistēma ir pārāk maza.
Ieteikums: PCR reakcijas sistēma ir pārāk maza, tādēļ noteikšanas precizitāte samazināsies.Lai atkārtotu reāllaika PCR eksperimentu, vislabāk ir izmantot kvantitatīvā PCR instrumenta ieteikto reakcijas sistēmu.

Slikta kvantitatīvo vērtību atkārtojamība

1. Instruments nedarbojas pareizi.
Ieteikums: starp katru instrumenta PCR atveri var būt kļūdas, kā rezultātā temperatūras pārvaldības vai noteikšanas laikā ir slikta reproducējamība.Lūdzu, pārbaudiet saskaņā ar atbilstošā instrumenta norādījumiem.

2.Parauga tīrība nav laba.
Ieteikums: netīri paraugi izraisīs sliktu eksperimenta reproducējamību, kas ietver veidnes un gruntskrāsu tīrību.Vislabāk ir atkārtoti attīrīt veidni, un primerus vislabāk var attīrīt ar SDS-PAGE.

3. PCR sistēmas sagatavošanas un uzglabāšanas laiks ir pārāk garš.
Ieteikums: izmantojiet reāllaika PCR sistēmu PCR eksperimentam tūlīt pēc sagatavošanas un neatstājiet to malā pārāk ilgi.

4. PCR amplifikācijas apstākļi nav piemēroti, un praimera secība vai koncentrācija ir nepareiza.
Ieteikums: apstipriniet praimeru secības pareizību un primer nav degradējies;ja pastiprināšanas signāls nav labs, mēģiniet pazemināt atkausēšanas temperatūru un atbilstoši noregulējiet primer koncentrāciju.

5. PCR sistēma ir nepareiza vai sistēma ir pārāk maza.
Ieteikums: PCR reakcijas sistēma ir pārāk maza, tādēļ noteikšanas precizitāte samazināsies.Lai atkārtotu reāllaika PCR eksperimentu, vislabāk ir izmantot kvantitatīvā PCR instrumenta ieteikto reakcijas sistēmu.