Autori: Wang Xiaoyan, Zhao Eryu

Vienība: Jiaozhou slimnīca, Dongfang slimnīca, kas saistīta ar Tongji universitāti

Pašlaik galvenais paraugu veids elpceļu patogēnu nukleīnskābju noteikšanai ir rīkles uztriepe.Ir daudz veidu, kā parasti tiek izmantoti paraugu saglabāšanas risinājumi, un tie visi ir jāatdzesē vai jāsasaldē transportēšanai un uzglabāšanai;Ir grūti kontrolēt visu zemas temperatūras procesu savākšanas un transportēšanas procesā, un ir grūti nodrošināt kvalitātes kontroli pirms paraugu pārbaudes.^[1-2].

RNāze (RNase) ir endonukleāze, kas hidrolizē RNS, galvenokārt saraujot fosfodiestera saites starp nukleotīdiem.RNāzes molekula ir ļoti stabila, tās struktūrā ir disulfīda saites, un tās darbībai nav nepieciešama divvērtīgu katjonu klātbūtne, tāpēc RNāze nav viegli denaturējama, un to ir viegli renaturēt pat pēc augstas temperatūras vai denaturantu lietošanas.RNāzes iedala endogēnās un eksogēnās.Endogēnās RNāzes var atbrīvot tajā pašā laikā, kad šūnas tiek plīsušas.Tāpēc endogēno RNāžu lomas likvidēšana ir ļoti būtisks solis RNS ekstrakcijas procesā.Eksogēnās RNāzes ir plaši izplatītas.RNāzes eksistē gaisā, cilvēka ādā, matos un siekalās, kas ir svarīgi iemesli vieglai RNS degradācijai.^[3].

Datu vaicājums

CANS-CL02-A009 “Medicīnas laboratoriju kvalitātes un kompetences akreditācijas vadlīniju piemērošana molekulārās diagnostikas jomā” tehniskajās prasībās ierosina atbilstoši pieteikumam formulēt atbilstošus ūdens kvalitātes standartus;Vienreizējās lietošanas hermētiski necaurlaidīgi konteineri:

RNāze/klasifikācija

(1) RNāze A

Ribonukleāze A (RNāze A), kas iegūta no liellopu aizkuņģa dziedzera, ir endoribonukleāze, kas var īpaši uzbrukt RNS pirimidīna atlieku 3' galam, sagriežot blakus esošo nukleotīdu veidoto citozīnu vai uracilu.Fosfodiestera saite, reakcijas galaprodukts ir 3′ pirimidīna nukleotīds un oligonukleotīds ar 3′ pirimidīna nukleotīdu galā.

(2) RNāze T1

Ribonukleāze T1 (RNase T1) ir iegūta no Aspergillus orjzae, tā īpaši iedarbojas uz guanīna 3'-gala fosfātu, un šķelšanās vieta atrodas starp guanīna 3'-fosfātu un blakus esošo nukleotīdu 5'-hidroksilgrupu.Reakcijas galaprodukts ir 3′guanilskābe un oligonukleotīdu fragmenti ar 3′guanilskābi beigās.

(3) RNāze H

Ribonukleāze H (RNase H) pirmo reizi tika atklāta no teļa aizkrūts dziedzera audiem, un tās kodējošais gēns tika klonēts Escherichia coli.Tas var īpaši noārdīt DNS: RNS virknes RNS hibrīda dupleksos, kā rezultātā veidojas oligonukleotīdi un mononukleotīdi ar 3′-OH un 5′-monofosfāta galiem, tas nevar noārdīt vienas vai divpavedienu DNS vai RNS.

RNāze

Funkcija un lietošana

Ribonukleāze var katalizēt ribonukleīnskābes (RNS) sadalīšanos, un to var mākslīgi sintezēt.Ārstniecisko ziedi lokāli lieto traumu un locītavu sāpju ārstēšanai.Saskaņā ar ziņojumiem ribonukleāze var mainīt saimniekšūnu metabolismu, kavēt vīrusu sintēzi, inhibēt gripas vīrusa proliferāciju in vitro un kavēt vakcīnas un herpes vīrusa veidošanos vistu embrijos.Klīniska ribonukleāzes ikdienas intramuskulāras injekcijas 180 mg lietošana, kas ir labvēlīga epidēmijas encefalīta ārstēšanai, ribonukleāze var katalizēt ribonukleīnskābes (RNS) degradāciju, un tagad to var mākslīgi sintezēt.Ārstniecisko ziedi lokāli lieto traumu un locītavu sāpju ārstēšanai.Saskaņā ar ziņojumiem ribonukleāze var mainīt saimniekšūnu metabolismu, kavēt vīrusu sintēzi, inhibēt gripas vīrusa proliferāciju in vitro un kavēt vakcīnas un herpes vīrusa veidošanos vistu embrijos.Ribonukleāzes ikdienas intramuskulāras injekcijas 180 mg klīniska lietošana ir labvēlīga epidēmiskā encefalīta ārstēšanai.

RNāze

Inhibitora definīcija

RNāzes inhibitora vienības definīcija: enzīma daudzums, kas nepieciešams, lai inhibētu 50% no 5ng RNāzes A aktivitātes, ir viena vienība.

Kā darbojas RNāzes inhibitori

Guanidīna izotiocianāts:

Guanidīna izotiocianāts ir organisks savienojums ar molekulāro formulu C2H6N4S.Galvenokārt izmanto bioloģiskajā medicīnā, ķīmiskos reaģentos utt. Guanidīna izotiocianāts ir proteīnu lizējošais līdzeklis, un to bieži izmanto kā galveno līzes šķīduma sastāvdaļu molekulārās diagnostikas reaģentos.Tas var lizēt audus, iznīcināt šūnu struktūru un atdalīt nukleīnskābi no nukleoproteīna, un tam ir spēcīga denaturācija līdz RNāzei.Pašlaik tas ir visefektīvākais RNāzes inhibitors.

TRIzol ir jauns kopējās RNS ekstrakcijas reaģents, kas var tieši iegūt kopējo RNS no šūnām vai audiem.Tas satur tādas vielas kā fenols un guanidīna izotiocianāts, kas var ātri izjaukt šūnas un kavēt šūnu izdalītās nukleāzes.

(Tomēr guanidīna izotiocianāts ir bīstams laboratorijas pētnieku veselībai.)

RNazīns:

Skābs glikoproteīns, kas iegūts no žurku aknām vai cilvēka blastodermas.Rnazīns ir nekonkurējošs RNāzes inhibitors, kas var saistīties ar dažādām RNāzēm, lai tās inaktivētu.

(Sīkāka informācija: https://www.foreivd.com/foreasy-rnase-inhibitor-product/)

Haugsta temperatūra:

Augsta temperatūra ir arī izplatīts proteīnu denaturācijas līdzeklis.

Dietilpirokarbonāts (DEPC):

DEPC ir spēcīgs, bet nepilnīgs RNāzes inhibitors, kas var inhibēt RNāzes aktivitāti, savienojoties ar RNāzes aktīvās grupas aminoskābes imidazola gredzenu, lai denaturētu proteīnus.

Vanadilribonukleozīdu komplekss:

Vanādija oksīda jonu un nukleozīdu veidots komplekss, kas saistās ar RNāzi pārejas vielu veidā, kas var gandrīz pilnībā inhibēt RNāzes aktivitāti

cits:

SDS, urīnviela, diatomīta zeme utt. arī zināmā mērā inhibē RNāzi.

Ekspertu atsauksmes

Li Yujie galvenais tehniķis

Laboratorijas departamenta direktors Jiaozhou slimnīcā, Dongfang slimnīca, kas saistīta ar Tongji universitāti

Lai novērstu eksogēnās RNāzes bioloģisko noārdīšanos, RNS ekstrakcijas procesa laikā bieži jāvalkā maskas, cimdi un cepures un jāmaina.Visi stikla trauki jācep žāvēšanas krāsnī 200°C temperatūrā ilgāk par 2 stundām.Cepšanai izmantotie materiāli, piemēram, plastmasa, jāapstrādā ar DEPC ūdeni un pēc tam jānomazgā ar destilētu ūdeni.Reaģenti vai ierīces, ko izmanto RNS ekstrakcijai, saglabāšanai un identificēšanai, ir jāpiešķir RNS, un ir jāizveido neatkarīga RNS darbības zona.

atsauces:

[1] Smith-Vaughan HC, Binks MJ, Beissbarth J u.c.Baktērijas un vīrusi nazofarneksā tieši pirms akūtu apakšējo elpceļu infekciju sākuma Austrālijas pamatiedzīvotāju bērniem [J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2018,37 (9): 1785-1794.

[2] Ķīnas profilaktiskās medicīnas asociācijas slimnīcu infekciju kontroles nodaļa.Klīnisko mikrobu paraugu savākšanas un pārbaudes vadlīnijas [J].Ķīniešu slimnīcas infekcijas žurnāls, 2018(20):3192-3200.

[3] “Klīniskā pārbaude Ten Thousand Why Molecular Biology Test Volume”