Es uzskatu, ka ikviens, veicot PCR reakcijas, vienmēr saskarsies ar šādām vai tādām problēmām, taču lielāko daļu no tām var iedalīt divās galvenajās problēmās:

Pārāk maza gēna šablona pastiprināšana (amplifikācija);
Pārāk daudz nemērķa gēnu amplifikācijas.
Piedevu izmantošana ir viena no izplatītākajām šo problēmu risināšanas stratēģijām.Parasti piedevām ir divi aspekti:
sekundārā struktūragēnu (sekundārā struktūra);
Samaziniet nespecifisko gruntēšanu.
Šodien redaktors īsumā iepazīstinās jūs ar parastajām piedevām PCR reakcijās un to funkcijām.
Piedevas, kas samazina sekundāro struktūru
sulfoksīds(DMSO)
gēnu paraugiar augstu GC saturu.Tomēr DMSO arī ievērojami samazina Taq polimerāzes aktivitāti.Tāpēc ikvienam ir jāsabalansē veidnes pieejamība un polimerāzes aktivitāte.Redaktors iesaka izmēģināt dažādas DSMO koncentrācijas, piemēram, no 2% līdz 10%, lai atrastu jūsu eksperimentam piemēroto koncentrāciju.
Nejonu mazgāšanas līdzekļi
Nejonu mazgāšanas līdzekļi, piemēram, 0,1–1% Triton X-100, Tween 20 vai NP-40, parasti samazina DNS sekundāro struktūru.Lai gan tas var palielināt šablona gēna amplifikāciju, tas radīs arī nespecifiskas amplifikācijas problēmas.Tātad šīs piedevas labi darbojas zemas ražības PCR reakcijās bez atkritumiem, bet ne tik labi salīdzinoši netīrām ĶTR reakcijām.Vēl viena nejonu mazgāšanas līdzekļu priekšrocība ir SDS piesārņojuma samazināšana.Parasti DNS ekstrakcijas procesa laikā SDS nonāk PCR posmā, kas ievērojami kavē polimerāzes aktivitāti.Tāpēc, pievienojot reakcijai 0,5% Tween-20 vai Tween-40, var neitralizēt SDS negatīvo ietekmi.
Betaīns_
Betaīns var uzlabot DNS amplifikāciju, samazinot sekundārās struktūras veidošanos, un parasti tas ir "noslēpumains" papildinājums komerciāliem PCR komplektiem.Ja vēlaties lietot betaīnu, jums jāievieto betaīns vai betaīna monohidrāts (Betaine vai Betaine monohidrāts), bet ne betaīna hidrohlorīds (Betain HCl), jāpielāgo līdz galīgajai koncentrācijai 1-1,7 M.Betaīns var arī palīdzēt uzlabot specifiskumu, jo tas novērš DNS kušanas/DNS denaturācijas atkarību no bāzes pāra sastāva.
Piedevas nespecifiskas gruntēšanas samazināšanai
Formamīds
Formamīds ir plaši izmantota organiskā PCR piedeva.To var apvienot ar galveno un nelielu DNS rievu, tādējādi samazinot galvenās DNS dubultās spirāles stabilitāti un pazeminot DNS kušanas temperatūru.PCR eksperimentos izmantotā formamīda koncentrācija parasti ir 1–5%.
Tetrametilsamonija hlorīds( TMAC)
Tetrametilamonija hlorīds var palielināt hibridizācijas specifiku (hibridizācijas specifiku) un paaugstināt DNS kušanas temperatūru.Tādējādi TMAC var noņemt nespecifisku gruntēšanu un samazināt nepareizu DNS un RNS saistīšanos.Ja lietojatdeģenerētie gruntiPCR reakcijā neaizmirstiet pievienot TMAC, ko parasti izmanto 15–100 mM koncentrācijā.
Citas izplatītas piedevas
Papildus divām iepriekš minētajām piedevu kategorijām PCR reakcijās ir daudz izplatītu piedevu, lai gan tām ir dažādas funkcijas, tās ir arī ļoti svarīgas.
Magnija jons
Magnija jons ir neaizstājams polimerāzes kofaktors (kofaktors), tas ir, bez magnija jona polimerāze ir neaktīva.Tomēr pārāk daudz magnija jonu var ietekmēt arī polimerāzes efektivitāti.Magnija jonu koncentrācija katrā PCR reakcijā būs atšķirīga.Helātus veidojošie aģenti (piemēram, EDTA vai citrāts), dNTP un proteīnu koncentrācija ietekmē magnija jonu koncentrāciju.Tātad, ja jums ir problēmas ar PCR eksperimentu, varat mēģināt mainīt dažādas magnija jonu koncentrācijas, piemēram, no 1,0 līdz 4,0 mM ar intervālu 0,5–1 mM.
Ir vērts atzīmēt, ka vairāki sasaldēšanas-atkausēšanas cikli var izraisīt magnija hlorīda šķīduma koncentrācijas stratifikāciju.Tāpēc pirms katras lietošanas tas pilnībā jāizšķīdina un pirms lietošanas labi jāsamaisa.
Liellopu seruma albumīns(Govs albumīns, BSA)
Molekulārās ķīmijas eksperimentos liellopu seruma albumīns ir ļoti izplatīta piedeva, īpaši restrikcijas enzīmu gremošanas un PCR eksperimentos.PCR reakcijās BSA palīdz samazināt piesārņotājus, piemēram, fenola savienojumus.Un tiek arī teikts, ka tas var samazināt reaģentu saķeri ar mēģenes sieniņu.PCR reakcijā parasti pievienotā BSA koncentrācija var sasniegt 0,8 mg/ml.
 
Saistītie produkti:
PCR varonis(ar krāsvielu)
PCR varonis