Gruntēšanas dizaina pamats (99% problēmu var atrisināt)
1. Primer garums: mācību grāmatai ir nepieciešami 15–30 bp, parasti apmēram 20 bp.Faktiskais stāvoklis ir labāks, lai tas būtu 18-24 bp, lai nodrošinātu specifiskumu, bet jo ilgāk, jo labāk, pārāk garš grunts arī samazinās specifiskumu un samazinās ražu.
2. Primer amplification span: 200-500bp ir piemērots, un īpašos apstākļos fragmentu var paplašināt līdz 10 kb.
3. Gruntēšanas bāze: G+C saturam jābūt 40-60%, pārāk mazs G+C pastiprināšanas efekts nav labs, pārāk daudz G+C var viegli parādīties nespecifiskas joslas.ATGC vislabāk tiek sadalīts nejauši, izvairoties no vairāk nekā 5 purīna vai pirimidīna nukleotīdu kopām.Multi-gc 5′ galam un starpsekvences, lai palielinātu stabilitāti, izvairieties no bagātīgas GC 3′ galā, bez GC pēdējām 3 bāzēm vai bez GC 3 no pēdējām 5 bāzēm.
4. Izvairieties no sekundārās struktūras praimeros un izvairieties no komplementācijas starp diviem praimeriem, īpaši komplementācijas 3' galā, pretējā gadījumā veidosies praimera dimērs un tiks ģenerētas nespecifiskas pastiprinātas joslas.
5. Bāzes primeru 3' galā, īpaši pēdējā un priekšpēdējā bāze, ir stingri jāsavieno pārī, lai izvairītos no PCR kļūmes nesapārotu gala bāzu dēļ.
6. Primeriem ir vai var tikt pievienotas atbilstošās šķelšanās vietas, un amplificētajai mērķa secībai vēlams būt atbilstošām šķelšanās vietām, kas ir ļoti noderīgi šķelšanās analīzei vai molekulārai klonēšanai.
7. Praimeru specifika: praimeriem nedrīkst būt acīmredzamas homoloģijas ar citām sekvencēm nukleīnskābju sekvenču datubāzē.
8. Iemācieties lietot programmatūru: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (šis tiešsaistes dizains darbojas vislabāk).
Iepriekš minētais saturs var atrisināt vismaz 99% grunts dizaina problēmu.
Kontrolējiet gruntskrāsas dizaina detaļas
1. Gruntskrāsas garums
Vispārējais grunts garums ir 18–30 bāzes.Kopumā svarīgākais faktors, kas nosaka grunts atkausēšanas temperatūru, ir gruntskrāsas garums.Parasti tiek izvēlēta grunts atkausēšanas temperatūra (Tm vērtība -5 ℃), un daži tieši izmanto Tm vērtību.Lai aptuveni aprēķinātu gruntskrāsu atkausēšanas temperatūru, var izmantot šādas formulas.
Ja primera garums ir mazāks par 20 bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Ja gruntējuma garums ir lielāks par 20 bp: 62,3 ℃+0,41 ℃ (%GC)-500/garums-5 ℃
Turklāt atlaidināšanas temperatūras aprēķināšanai var izmantot arī daudzas programmatūras, aprēķina princips būs atšķirīgs, tāpēc dažreiz aprēķinātajā vērtībā var būt neliela atstarpe.Lai optimizētu PCR reakcijas, vislabākajai efektivitātei un specifiskumam tiek izmantoti īsākie primeri, kas nodrošina atlaidināšanas temperatūru, kas nav zemāka par 54 ℃.
Kopumā katram papildu nukleotīdam praimera specifika palielinās par četriem koeficientiem, tādējādi lielākajai daļai lietojumu minimālais primera garums ir 18 nukleotīdi.Praimera garuma augšējā robeža nav īpaši svarīga, galvenokārt saistīta ar reakcijas efektivitāti.Entropijas dēļ, jo garāks ir primer, jo mazāks ir ātrums, ar kādu tas atkvēlojas, lai saistīties ar mērķa DNS, veidojot stabilu divpavedienu veidni DNS polimerāzes saistīšanai.
Izmantojot programmatūru, lai izstrādātu praimerus, primeru garumu var noteikt pēc TM vērtības, jo īpaši fluorescences kvantitatīvās PCR primeriem, TM = 60 ℃ vai tamlīdzīgi jākontrolē.
2.GC saturs
Parasti G+C saturs praimeru sekvencēs ir 40% ~ 60%, un GC saturs un Tm vērtība primeru pārim ir jāsaskaņo.Ja primeram ir nopietna GC vai AT tendence, gruntskrāsas 5 'galam var pievienot atbilstošu A, T vai G un C asti.
3. Atkausēšanas temperatūra
Atkausēšanas temperatūrai jābūt par 5 ℃ zemākai par ķēdes atdalīšanas temperatūru.Ja primeru bāzu skaits ir mazs, atkausēšanas temperatūru var atbilstoši palielināt, kas var palielināt PCR specifiku.Ja bāzu skaits ir liels, atkausēšanas temperatūru var atbilstoši samazināt.Atlaidināšanas temperatūras starpība starp primeru pāri 4℃ ~ 6℃ neietekmēs PCR iznākumu, bet ideālā gadījumā primeru pāra atkvēlināšanas temperatūra ir vienāda, kas var mainīties no 55℃ ~ 75℃.
4. Izvairieties no pastiprināšanas veidnes sekundārās struktūras apgabala
Izvēloties pastiprināto fragmentu, vislabāk ir izvairīties no veidnes sekundārās struktūras reģiona.Mērķa fragmenta stabilo sekundāro struktūru var paredzēt un novērtēt ar atbilstošu datora programmatūru, kas ir noderīga veidņu atlasei.Eksperimentālie rezultāti liecina, ka izplešanās bieži vien ir neveiksmīga, ja izvēršamā reģiona brīvā enerģija (△G) ir mazāka par 58,6 lkJ/mol.
5. Nesakritība ar mērķa DNS
Ja pastiprinātā mērķa DNS secība ir liela, primer var saistīties ar vairākām mērķa DNS daļām, kā rezultātā rezultātā parādās vairākas joslas.Šoreiz nepieciešams izmantot BLAST programmatūras testēšanu, mājaslapu:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Atlasiet Izlīdzināt divas secības (bl2seq).
Praimeru sekvenču ielīmēšana 1. zonā un mērķa DNS sekvences 2. zonā ir savstarpēji aizvietojama, un BLAST aprēķina komplementāras, antisensas un citas iespējas, tāpēc lietotājiem nav jāpamana, vai abas ķēdes ir sajūtu ķēdes.Varat arī ievadīt GI numuru, ja datu bāzē zināt secības GI numuru, tāpēc jums nav jāielīmē liela secības sadaļa.Visbeidzot, noklikšķiniet uz Align at 3, lai redzētu, vai primeram mērķa DNS ir vairākas homologas vietas.
6. Gruntēšanas terminālis
Primer 3' gals ir vieta, kur sākas pagarinājums, tāpēc ir svarīgi novērst neatbilstību sākšanos tur.3 'galam nevajadzētu būt vairāk par 3 secīgiem G vai C, jo tas izraisīs primeru kļūdaini iedarbināšanu G+C bagātināšanas secības reģionā.3' gals nevar veidot nekādu sekundāro struktūru, izņemot īpašās PCR (AS-PCR) reakcijās, primera 3' gals nevar būt nesakritīgs.Piemēram, ja tiek pastiprināts kodējošais reģions, primera 3' gals nedrīkst tikt pārtraukts kodona trešajā pozīcijā, jo kodona trešā pozīcija ir pakļauta deģenerācijai, kas ietekmēs amplifikācijas specifiku un efektivitāti.Lietojot aneksijas primerus, skatiet kodona lietošanas tabulu, pievērsiet uzmanību bioloģiskajai izvēlei, neizmantojiet aneksijas primerus 3′ galā un izmantojiet augstāku primeru koncentrāciju (1 uM-3 uM).
7. Primeru sekundārā struktūra
Pašiem gruntskrāsām nevajadzētu būt komplementārām sekvencēm, pretējā gadījumā paši praimeri salocīsies matadata struktūrās, un šī sekundārā struktūra ietekmēs gruntskrāsu un šablonu saistīšanos sterisku šķēršļu dēļ.Ja tiek izmantots mākslīgs vērtējums, pašu praimeru nepārtrauktās komplementārās bāzes nedrīkst būt lielākas par 3 bp.Starp abiem primeriem nevajadzētu būt komplementaritātei, jo īpaši jāizvairās no 3' gala komplementāras pārklāšanās, lai novērstu praimeru dimeru veidošanos.Kopumā starp primeru pāriem nedrīkst būt vairāk par 4 secīgām bāzu homoloģijai vai komplementaritātei.
8. Pievienojiet marķierus vai lokusus
5' galam ir maza ietekme uz amplifikācijas specifiku, un tāpēc to var modificēt, neietekmējot amplifikācijas specifiku.Praimera 5. gala modifikācija ietvēra: enzīma restrikcijas vietas pievienošanu;Iezīmēts biotīns, fluorescence, digoksīns, Eu3+ utt. Ieviest proteīnu saistošās DNS sekvences;Mutācijas vietu ieviešana, mutāciju sekvenču ievietošana un iztrūkums, promotora sekvenču ieviešana utt. Papildu bāzes vairāk vai mazāk ietekmēs amplifikācijas efektivitāti un palielinās praimera dimēra veidošanās iespēju, taču nākamajam solim ir jāpiekāpjas.Praimera 5′ galam var pievienot papildu sekvences, kas neeksistē mērķa sekvencē, piemēram, restrikcijas vietas un promotora sekvences, neietekmējot specifiku.Šīs sekvences nav iekļautas primera Tm vērtību aprēķinā, taču tām jāpārbauda komplementaritāte un iekšējā sekundārā struktūra.
9. Apakškloni
Lielāko daļu laika PCR ir tikai provizoriska klonēšana, un tad mums ir nepieciešams subklonēt mērķa fragmentu dažādos vektoros, tāpēc mums ir jāizstrādā papildu bāzes nākamajai darbībai PCR posmā.
Tālāk ir apkopotas dažas sekvences, kas paredzētas subklonēšanai.
Tika pievienota restrikcijas endonukleāzes restrikcijas vieta
Enzīmu restrikcijas vietu pievienošana ir visbiežāk izmantotā metode PCR produktu subklonēšanai.Parasti šķelšanās vieta ir sešas bāzes, papildus šķelšanās vietas 5 'galam jāpievieno 2 ~ 3 aizsargājošas bāzes.Tomēr dažādiem fermentiem nepieciešamo aizsargbāzu skaits ir atšķirīgs.Piemēram, SalⅠ nav nepieciešama aizsargbāze, EcoRⅤ nepieciešama 1 aizsargbāze, NotⅠ nepieciešama 2 aizsargbāze un Hind Ⅲ nepieciešama 3 aizsargbāze.
LIC pievieno asti
Pilns LIC nosaukums ir Ligation-Independent klonēšana, klonēšanas metode, ko Navogen izgudroja īpaši savai pET vektora daļai.Ar LIC metodi sagatavotajam pET nesējam ir nekomplementāri 12-15 bāzes vienas virknes lipīgie gali, kas papildina atbilstošos lipīgos galus uz mērķa ieliktņa fragmenta.Amplifikācijas nolūkos ievietotā fragmenta praimera 5′ secībai jāpapildina LIC vektors.T4 DNS polimerāzes 3′→5′ ekstranektiskā aktivitāte ievietotajā fragmentā pēc neilga laika var izveidot vienas ķēdes lipīgu galu.Tā kā produktu var izveidot tikai no sagatavotā ieliktņa fragmenta un vektora savstarpējas atkausēšanas, šī metode ir ļoti ātra un efektīva, un tā ir virzīta klonēšana.
Režisēts TA klons pievieno asti
TA klonēšana nespēja mērķēt fragmentu vektorā, tāpēc vēlāk Invitrogen ieviesa vektoru, kas varēja mērķēt uz klonēšanu, kura vienā galā bija četras ievērojamas bāzes GTGGS.Tāpēc, izstrādājot PCR primerus, attiecīgi jāpievieno komplementāras sekvences, lai fragmentus varētu “orientēt”.
Ja jums trūkst laika, varat izmēģināt tiešo sintēzi, apvienojot gēnu ar vektoru, ko mēs saucam par ET gēnu sintēzi muzelistiem.
D. In-Fusion klonēšanas metode
Nav nepieciešama ligāze, nav nepieciešama ilgstoša reakcija.Kamēr tiek ieviesta secība abos linearizētā vektora galos Praimeru projektēšanā, pēc tam PCR produktu un linearizēto vektoru pievieno BSA saturošajam infūzijas enzīma šķīdumam un novieto istabas temperatūrā uz pusstundu, transformāciju var veikt.Šī metode ir īpaši piemērota liela apjoma konvertēšanai.
10. Sapludināt grunti
Dažreiz par primer dizainu ir zināma tikai ierobežota secības informācija.Piemēram, ja ir zināma tikai aminoskābju secība, var izveidot saplūšanas praimeru.Apvienošanās primer ir dažādu secību maisījums, kas atspoguļo visas dažādās bāzes iespējas, kas kodē vienu aminoskābi.Lai palielinātu specifiku, varat atsaukties uz kodona izmantošanas tabulu, lai samazinātu aneksiju atbilstoši dažādu organismu bāzes izmantošanas preferencēm.Hipoksantīnu var savienot pārī ar visām bāzēm, lai samazinātu grunts atkausēšanas temperatūru.Neizmantojiet pievienotās bāzes primera 3′ galā, jo pēdējo 3 bāzu atkausēšana 3′ galā ir pietiekama, lai uzsāktu PCR nepareizajā vietā.Tiek izmantotas augstākas primeru koncentrācijas (1 μM līdz 3 μM), jo daudzos aneksijas maisījumos primeri nav specifiski mērķa veidnei.
PCR izejvielaskontrole
1. Gruntskrāsas daudzums
Katra praimera koncentrācija ir 0,1 ~ 1 umol vai 10 ~ 100 pmol.Labāk ir iegūt vajadzīgo rezultātu ar mazāko gruntskrāsas daudzumu.Augsta praimera koncentrācija izraisīs nesakritību un nespecifisku pastiprināšanos, kā arī palielinās dimēru veidošanās iespēju starp praimeriem.
2. Primer koncentrācija
Primeru koncentrācija ietekmē specifiku.Optimālā grunts koncentrācija parasti ir no 0,1 līdz 0,5 μM.Augstākas praimeru koncentrācijas izraisa nespecifisku produktu pastiprināšanos.
3. Gruntskrāsas atkausēšanas temperatūra
Vēl viens svarīgs gruntskrāsu parametrs ir kušanas temperatūra (Tm).Šī ir temperatūra, kad 50% praimeru un komplementāro sekvenču ir attēloti kā divpavedienu DNS molekulas.Tm ir nepieciešams, lai iestatītu PCR atkausēšanas temperatūru.Ideālā gadījumā atkausēšanas temperatūra ir pietiekami zema, lai nodrošinātu efektīvu primeru atkausēšanu ar mērķa secību, bet pietiekami augsta, lai samazinātu nespecifisko saistīšanos.Saprātīga atkausēšanas temperatūra no 55 ℃ līdz 70 ℃.Rūdīšanas temperatūra parasti ir iestatīta par 5 ℃ zemāka nekā gruntskrāsas Tm.
Ir vairākas formulas Tm iestatīšanai, kas ievērojami atšķiras atkarībā no izmantotās formulas un gruntskrāsu secības.Tā kā lielākā daļa formulu nodrošina aptuveno Tm vērtību, visas atkausēšanas temperatūras ir tikai sākumpunkts.Specifiskumu var uzlabot, analizējot vairākas reakcijas, kas pakāpeniski paaugstina atkausēšanas temperatūru.Sāciet zem aprēķinātās Tm-5 ℃ un pakāpeniski palieliniet atkausēšanas temperatūru ar soli 2 ℃.Augstāka atkausēšanas temperatūra samazinās gruntēšanas dimēru un nespecifisku produktu veidošanos.Lai iegūtu labākos rezultātus, abiem primeriem ir jābūt aptuvenām Tm vērtībām.Ja gruntskrāsu pāru Tm starpība ir lielāka par 5℃, primeriem tiks parādīts ievērojams kļūdains starts, ciklā izmantojot zemāku atkvēlināšanas temperatūru.Ja abi grunti Tm atšķiras, iestatiet atkvēlināšanas temperatūru uz 5 ℃ zemāku par zemāko Tm.Alternatīvi, lai palielinātu specifiskumu, vispirms var veikt piecus ciklus atlaidināšanas temperatūrā, kas paredzēta augstākai Tm, pēc tam atlikušos ciklus atlaidināšanas temperatūrā, kas paredzēta zemākai Tm.Tas ļauj ierobežotos apstākļos iegūt daļēju galamērķa veidnes kopiju.
4. Gruntējuma tīrība un stabilitāte
Pielāgotu praimeru standarta tīrība ir piemērota lielākajai daļai PCR lietojumu.Benzoilgrupu un izobutilgrupu atdalīšana, atsāļojot, ir minimāla, un tāpēc tas netraucē PCR.Dažām lietojumprogrammām ir nepieciešama attīrīšana, lai sintēzes procesā noņemtu visas nepilna garuma sekvences.Šīs saīsinātās sekvences rodas tāpēc, ka DNS sintēzes ķīmijas efektivitāte nav 100%.Šis ir apļveida process, kurā tiek izmantotas atkārtotas ķīmiskas reakcijas, jo katra bāze tiek pievienota, lai DNS izveidotu no 3′ līdz 5′.Jūs varat neizdoties jebkurā ciklā.Garākiem primeriem, īpaši tiem, kas ir lielāki par 50 bāzēm, ir liela daļa saīsinātu secību, un tiem var būt nepieciešama attīrīšana.
Primeru iznākumu ietekmē sintētiskās ķīmijas un attīrīšanas metodes efektivitāte.Biofarmācijas uzņēmumi, piemēram, Cytology un Shengong, izmanto minimālo OD vienību, lai nodrošinātu kopējo oligonukleozīdu izlaidi.Pielāgotas gruntskrāsas tiek piegādātas sausa pulvera veidā.Vislabāk ir atkārtoti izšķīdināt primerus TE, lai gala koncentrācija būtu 100 μM.TE ir labāks par dejonizētu ūdeni, jo ūdens pH bieži ir skābs un izraisīs oligonukleozīdu hidrolīzi.
Gruntskrāsu stabilitāte ir atkarīga no uzglabāšanas apstākļiem.Sausais pulveris un izšķīdinātie grunti jāuzglabā -20 ℃.Primerus, kas izšķīdināti TE koncentrācijās, kas pārsniedz 10 μM, var stabili uzglabāt -20 ℃ temperatūrā 6 mēnešus, bet tos var uzglabāt tikai istabas temperatūrā (15 ℃ līdz 30 ℃) mazāk nekā 1 nedēļu.Sausā pulvera gruntskrāsas var uzglabāt -20 C temperatūrā vismaz 1 gadu un istabas temperatūrā (15 C līdz 30 C) līdz 2 mēnešiem.
5. Fermenti un to koncentrācijas
Pašlaik izmantotā Taq DNS polimerāze pamatā ir gēnu inženierijas enzīms, ko sintezē koliformas baktērijas.Enzīma daudzums, kas nepieciešams, lai katalizētu tipisku PCR reakciju, ir aptuveni 2,5 U (attiecas uz kopējo reakcijas tilpumu 100 ul).Ja koncentrācija ir pārāk augsta, tas var izraisīt nespecifisku pastiprināšanos;ja koncentrācija ir pārāk zema, tiks samazināts sintētiskā produkta daudzums.
6. dNTP kvalitāte un koncentrācija
dNTP kvalitāte ir cieši saistīta ar koncentrāciju un PCR amplifikācijas efektivitāti.dNTP pulveris ir granulēts, un tā mainīgums zaudē savu bioloģisko aktivitāti, ja tas tiek nepareizi uzglabāts.dNTP šķīdums ir skābs, un tas jālieto augstā koncentrācijā ar 1M NaOH vai 1M Tris.HCL buferšķīdumu, lai noregulētu tā pH uz 7,0 ~ 7,5, neliels daudzums apakšiepakojuma, saldēta uzglabāšana -20 ℃.Vairākkārtēja sasaldēšana un atkausēšana pasliktinās dNTP.PCR reakcijā dNTP jābūt 50 ~ 200 umol/l.Īpaši uzmanība jāpievērš tam, lai četru DNTPS koncentrācija būtu vienāda (vienāds mols preparāts).Ja kāda no tām koncentrācija atšķiras no citām (augstāka vai zemāka), tiks radīta neatbilstība.Pārāk zema koncentrācija samazinās PCR produktu iznākumu.dNTP var apvienoties ar Mg2+ un samazināt brīvā Mg2+ koncentrāciju.
7. Šablona (mērķgēna) nukleīnskābe
Veidnes nukleīnskābes daudzums un attīrīšanas pakāpe ir viena no galvenajām PCR panākumu vai neveiksmju saitēm.Tradicionālās DNS attīrīšanas metodes paraugu sagremošanai un iznīcināšanai parasti izmanto SDS un proteāzi K.Galvenās SDS funkcijas ir: izšķīdināt lipīdus un proteīnus uz šūnas membrānas, tādējādi iznīcinot šūnas membrānu, izšķīdinot membrānas proteīnus, un disociēt šūnā kodolproteīnus, SDS var arī apvienoties ar olbaltumvielām un nogulsnēties;Proteāze K var hidrolizēt un sagremot olbaltumvielas, īpaši histonus, kas saistīti ar DNS, un pēc tam izmantot organisko šķīdinātāju fenolu un hloroformu, lai ekstrahētu olbaltumvielas un citus šūnu komponentus, un izmantot etanolu vai izopropilspirtu, lai izgulsnētu nukleīnskābi.Ekstrahēto nukleīnskābi var izmantot kā veidni PCR reakcijām.Vispārējiem klīniskās noteikšanas paraugiem var izmantot ātru un vienkāršu metodi, lai izšķīdinātu šūnas, lizētu patogēnus, sagremotu un izņemtu olbaltumvielas no hromosomām uz brīviem mērķa gēniem, un tieši izmantotu PCR amplifikācijai.RNS šablona ekstrakcijā parasti izmanto guanidīna izotiocianāta vai proteāzes K metodi, lai novērstu RNS noārdīšanos RNS.
8.Mg2+ koncentrācija
Mg2+ būtiski ietekmē PCR amplifikācijas specifiku un iznākumu.Vispārējā PCR reakcijā, kad dažādu dNTP koncentrācija ir 200 umol/L, atbilstošā Mg2+ koncentrācija ir 1,5 ~ 2,0 mmol/L.Mg2+ koncentrācija ir pārāk augsta, reakcijas specifika samazinās, notiek nespecifiska amplifikācija, pārāk zema koncentrācija samazinās Taq DNS polimerāzes aktivitāti, kā rezultātā samazināsies reakcijas produkti.
Magnija joni ietekmē vairākus PCR aspektus, piemēram, DNS polimerāzes aktivitāti, kas ietekmē ražu;Vēl viens piemērs ir grunts atkausēšana, kas ietekmē specifiku.dNTP un veidne saistās ar magnija jonu, samazinot enzīmu darbībai nepieciešamo brīvā magnija jonu daudzumu.Optimālā magnija jonu koncentrācija dažādiem praimeru pāriem un veidnēm atšķiras, bet tipiskā PCR sākuma koncentrācija ar 200 μM dNTP ir 1,5 mM (piezīme: reāllaika kvantitatīvai PCR izmantojiet 3 līdz 5 mM magnija jonu šķīdumu ar fluorescējošu zondi).Augstākas brīvo magnija jonu koncentrācijas palielina ražu, bet arī palielina nespecifisko pastiprinājumu un samazina precizitāti.Lai noteiktu optimālo koncentrāciju, magnija jonu titrēšana tika veikta ar soli 0,5 mM no 1 mM līdz 3 mM.Lai samazinātu atkarību no magnija jonu optimizācijas, var izmantot Platinum Taq DNS polimerāzi.Platīna Taq DNS polimerāze spēj uzturēt darbību plašākā magnija jonu koncentrāciju diapazonā nekā Taq DNS polimerāze, un tāpēc tai nepieciešama mazāka optimizācija.
9. Pcr veicinošas piedevas
Atkvēlināšanas temperatūras optimizācija, primer dizains un magnija jonu koncentrācija ir pietiekama, lai vairums veidņu ļoti specifiski pastiprinātu;tomēr dažām veidnēm, tostarp tām, kurām ir augsts GC saturs, ir nepieciešami papildu pasākumi.Piedevas, kas ietekmē DNS kušanas temperatūru, ir vēl viens veids, kā uzlabot produkta specifiku un ražu.Lai iegūtu labākos rezultātus, ir nepieciešama pilnīga veidnes denaturācija.
Turklāt sekundārā struktūra novērš praimeru saistīšanos un enzīmu pagarināšanu.
PCR piedevas, tostarp formamīds, DMSO, glicerīns, betaīns un PCRx pastiprinātāja šķīdums, uzlabo pastiprināšanu.To iespējamais mehānisms ir samazināt kušanas temperatūru, tādējādi veicinot primeru atkausēšanu un palīdzot DNS polimerāzes paplašināšanai caur sekundārās struktūras reģionu.PCRx risinājumam ir arī citas priekšrocības.Ja to lieto kopā ar Platinum Taq DNS polimerāzi un Platinum Pfx DNS polimerāzi, nepieciešama minimāla magnija jonu optimizācija.Tādējādi Platinum tehnika tiek apvienota ar piedevu, lai palielinātu specifiskumu, vienlaikus samazinot trešās pieejas, magnija jonu optimizācijas, atkarību.Lai iegūtu labākos rezultātus, ir jāoptimizē piedevu koncentrācija, jo īpaši DMSO, formamīds un glicerīns, kas inhibē Taq DNS polimerāzi.
10. Karstais starts
Karstās palaišanas PCR ir viena no vissvarīgākajām metodēm, lai uzlabotu PCR specifiku papildus labam primer dizainam.Lai gan Taq DNS polimerāzes optimālā pagarinājuma temperatūra ir 72 ℃, polimerāze paliek aktīva istabas temperatūrā.Tādējādi nespecifiski produkti tiek ražoti, ja turēšanas temperatūra ir zemāka par atkvēlināšanas temperatūru PCR reakcijas sagatavošanas laikā un termiskā cikla sākumā.Kad šie nespecifiskie produkti ir izveidoti, tie tiek efektīvi pastiprināti.Karstās palaišanas PCR ir īpaši efektīva, ja vietas, ko izmanto primeru projektēšanai, ierobežo ģenētisko elementu atrašanās vieta, piemēram, uz vietni vērstas mutācijas, ekspresijas klonēšana vai DNS inženierijā izmantoto ģenētisko elementu konstruēšana un manipulācijas.
Izplatīta metode Taq DNS polimerāzes aktivitātes ierobežošanai ir PCR reakcijas šķīduma sagatavošana uz ledus un ievietošana iepriekš uzkarsētā PCR aparātā.Šī metode ir vienkārša un lēta, taču tā nepabeidz fermenta aktivitāti un līdz ar to pilnībā nenovērš nespecifisku produktu pastiprināšanos.
Termiskā gruntēšana aizkavē DNS sintēzi, inhibējot būtisku komponentu, līdz PCR aparāts sasniedz denaturācijas temperatūru.Lielākā daļa manuālās termiskās ierosināšanas metožu, tostarp aizkavēta Taq DNS polimerāzes pievienošana, ir apgrūtinošas, jo īpaši lielas caurlaidības lietojumos.Citās termiskās gruntēšanas metodēs izmanto vaska vairogu, lai aptvertu būtisku komponentu, tostarp magnija jonus vai fermentus, vai fiziski izolētu reaktīvos komponentus, piemēram, veidnes un buferus.Termiskā cikla laikā dažādi komponenti tiek atbrīvoti un sajaukti kopā, vaskam kūstot.Tāpat kā manuālā karstās palaišanas metode, arī vaska vairoga metode ir apgrūtinoša un pakļauta piesārņojumam, un tā nav piemērota lietojumiem ar lielu caurlaidspēju.
Platīna DNS polimerāze ir ērta un efektīva automātiskai karstās palaišanas PCR.Platīna Taq DNS polimerāze sastāv no rekombinantās Taq DNS polimerāzes, kas apvienota ar monoklonālu antivielu pret Taq DNS polimerāzi.Antivielas tiek formulētas ar PCR, lai kavētu fermentu aktivitāti ilgstošas temperatūras uzturēšanas laikā.Taq DNS polimerāze tika izlaista reakcijā 94 ℃ denaturācijas posma izolācijas laikā, atjaunojot pilnu polimerāzes aktivitāti.Pretstatā ķīmiski modificētajai Taq DNS polimerāzei termiskai ierosināšanai, Platīna enzīmam nav nepieciešama ilgstoša izolācija 94 ℃ temperatūrā (10 līdz 15 minūtes), lai aktivizētu polimerāzi.Izmantojot PlatinumTaq DNS polimerāzi, 90% Taq DNS polimerāzes aktivitātes tika atjaunoti pēc 2 minūtēm 94 ℃ temperatūrā.
11. Nest-PCR
Secīgas pastiprināšanas kārtas, izmantojot ligzdotos primerus, var uzlabot specifiskumu un jutīgumu.Pirmā kārta ir standarta pastiprināšana no 15 līdz 20 cikliem.Neliela sākotnējā amplifikācijas produkta daļa tika atšķaidīta 100 līdz 1000 reizes un pievienota otrajai amplifikācijas kārtai 15 līdz 20 cikliem.Alternatīvi sākotnējā pastiprinātā produkta izmēru var noteikt, attīrot gēlu.Otrajā amplifikācijas kārtā tiek izmantots ligzdots primer, kas var saistīties ar mērķa secību pirmajā primerā.Ligzdotās PCR izmantošana samazina vairāku mērķa vietu amplifikācijas iespēju, jo ir maz mērķa sekvenču, kas papildina abas primeru kopas.Tas pats kopējais ciklu skaits (30 līdz 40) ar tiem pašiem primeriem pastiprināja nespecifiskās vietas.Nested PCR palielina ierobežotu mērķa sekvenču (piemēram, retu mrnas) jutību un uzlabo sarežģītas PCRS (piemēram, 5′ RACE) specifiku.
12. Dilstošā PCR
Dilstošā PCR uzlabo specifiskumu, izmantojot stingrus atkausēšanas apstākļus pirmajos PCR ciklos.Cikls sākas pie atlaidināšanas temperatūras, kas ir aptuveni par 5 ℃ augstāka nekā aprēķinātais Tm, pēc tam katrs cikls tiek samazināts par 1 ℃ līdz 2 ℃, līdz atlaidināšanas temperatūra ir zemāka par Tm 5 ℃.Tiks pastiprināta tikai galamērķa veidne ar visaugstāko homoloģiju.Šie produkti turpina paplašināties nākamajos ciklos, izspiežot pastiprinātos nespecifiskos produktus.Dilstošā PCR ir noderīga metodēm, kurās nav zināma homoloģijas pakāpe starp praimeru un mērķa veidni, piemēram, AFLP DNS pirkstu nospiedumu noņemšanai.
Saistītie PCR komplekti
2 × PCR varonisTMMix sistēmai ir augstāka tolerance pret PCR inhibitoriem nekā parastajai PCR Mix sistēmai, un tā var viegli tikt galā ar dažādu sarežģītu veidņu PCR pastiprināšanu.Unikālā reakcijas sistēma un augstas efektivitātes Taq Hero padara PCR reakciju ar augstāku pastiprināšanas efektivitāti, specifiskumu un jutīgumu.
Augstāka pastiprināšanas efektivitāte
Tam ir 5'→3' DNS polimerāzes aktivitāte un 5'→3' eksonukleāzes aktivitāte, bez 3'→5' eksonukleāzes aktivitātes.
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Specifisks optimizēts buferis un karstās palaišanas Taq enzīms var novērst nespecifisku amplifikāciju un primer dimēra veidošanos
Augsta jutība — var noteikt zemas veidnes kopijas
Komplektā tiek izmantots unikāls Foregene reversās transkripcijas reaģents un Foregene HotStar Taq DNS polimerāze apvienojumā ar unikālu reakcijas sistēmu, lai efektīvi uzlabotu reakcijas amplifikācijas efektivitāti un specifiskumu.
Ievietošanas laiks: 2023. gada 9. maijs
