Tiešā PCR ir reakcija, kas tieši izmanto dzīvnieku vai augu audus amplifikācijai bez nukleīnskābju ekstrakcijas.Daudzos veidos tiešā PCR darbojas kā parastais PCR

Galvenā atšķirība ir tiešajā PCR izmantotajā pielāgotajā buferī, paraugu var tieši pakļaut PCR reakcijai bez nukleīnskābju ekstrakcijas, taču ir atbilstošas ​​prasības attiecībā uz fermentu toleranci un tiešā PCR reakcijā iesaistītā bufera savietojamību.

Lai gan parastajos paraugos ir vairāk vai mazāk PCR inhibitoru, tiešā PCR joprojām var panākt ticamu pastiprināšanu fermentu un buferu iedarbībā.Tradicionālajai PCR reakcijai kā veidne ir nepieciešama augstas kvalitātes nukleīnskābe, kas var kavēt vienmērīgu PCR reakcijas norisi, ja veidnē ir proteīni un citi piemaisījumi.Tiešā PCR šobrīd ir viena no populārākajām tehnoloģijām molekulārās diagnostikas jomā.

01 Tiešo PCR sākotnēji izmantoja dzīvniekiem un augiem

Agrākais tiešās PCR pielietojums ir dzīvnieku un augu jomā, piemēram, žurku, kaķu, vistu, trušu, aitu, liellopu asinīm un matiem, augu lapām un sēklām utt., ko izmanto genotipa noteikšanai, transgēnu, plazmīdu noteikšanai, gēnu izslēgšanas analīzei, DNS avota identificēšanai, sugu identifikācijai, SNP analīzei un citām jomām.

Šiem laukiem ir dažas kopīgas iezīmes, tas ir, mērķa gēna saturs ir salīdzinoši augsts un nukleīnskābju ekstrakcija ir apgrūtinoša, tāpēc tiešā PCR var ne tikai ietaupīt laiku un nedaudz ietekmēt rezultātus, bet arī ietaupīt izmaksas.

Patogēnu noteikšanai izmantotā tiešā PCR ir pēdējo gadu jautājums, daži PCR reaģentu ražotāji ir pielikuši daudz pūļu šajā virzienā, radot inovācijas.Īpaši šīs COVID-19 epidēmijas laikā tirgū ir parādījušies daudzi šādi noteikšanas produkti, piemēram, SARS-CoV-2 nukleīnskābju noteikšanas komplekts (multipleksā PCR fluorescējošās zondes metode), ko izpētījis un izstrādājis Foregene un kas izmanto reāllaika RT PCR tehnoloģiju (rRT-PCR) kvalitatīvai SARS-2 nucleopharyngealV noteikšanai SARS-CoV-2. tamponu paraugi.

Foregene ir viens no uzņēmumiem, kas izmanto Direct PCR tehnoloģiju, lai noteiktu normālu ORF1ab, N, E unvariants nukleīnskābes cilvēka nazofaringijas vai mutes un rīkles uztriepes paraugos, piemēram, SARS-CoV-2 B.1.1.7 cilts (AK), B.1.351 līnija (ZA), B.1.617 līnija (IND) un P.1 līnija (BR).

02  Tiešai PCR nepieciešamie reaģenti

Lizāta paraugs

Parauga lizātu var konfigurēt pats vai iegādāties.Dažādu zīmolu lizātu sastāva atšķirības padarīs atšķirīgu lizēšanas spēju, un tad lizēšanas laiks būs nedaudz atšķirīgs.Piemēram, lai sagatavotu dzīvnieku audu paraugus, parasti ir ieteicama 30 minūšu vai nakts lizēšana, un vīrusa līzes šķīdums svārstās no 3 līdz 10 minūtēm.

PCR galvenais maisījums

Lai pastiprinātu specifisko amplifikāciju un palielinātu amplifikācijas spēju, ieteicams izmantot karstās palaišanas DNS polimerāzi.Tiešās PCR kodols ir ļoti toleranta polimerāze.

Likvidējiet vai inhibējiet komponentus paraugā, kas ietekmē DNS amplifikāciju

Pēc parauga apstrādes ar lizātu tiks atbrīvoti olbaltumvielas, lipīdi un citas šūnu atliekas, šīs vielas kavēs PCR reakciju.Tāpēc tiešai PCR ir nepieciešams pievienot atbilstošus noņemšanas vai inhibitorus, lai samazinātu šo faktoru ietekmi.

03  Piecu tiešās PCR zināšanu punktu kolekcija

Pirmkārt, Direct PCR tehnoloģija ir tieša PCR tehnoloģija dažādiem bioloģiskiem paraugiem.Saskaņā ar šo tehnisko stāvokli nav nepieciešams atdalīt un ekstrahēt nukleīnskābi, tieši izmantot audu paraugu kā objektu un pievienot mērķa gēnu primerus, lai veiktu PCR reakciju.

Otrkārt, tiešās PCR tehnoloģija ir ne tikai tradicionāla DNS veidņu amplifikācijas tehnoloģija, bet arī ietver RNS veidņu reversās transkripcijas PCR.

Treškārt, tiešā PCR tehnoloģija ne tikai tieši veic ikdienas kvalitatīvas PCR reakcijas uz audu paraugiem, bet arī ietver reāllaika qPCR reakcijas, kas prasa, lai reakcijas sistēmai būtu spēcīga pretfona fluorescences traucējumu spēja un endogēnā fluorescence slāpētu antagonistu spēju.

Ceturtkārt, tiešās PCR tehnoloģijas mērķa paraugiem ir nepieciešams tikai atbrīvot nukleīnskābju šablonus, un tie neizņem proteīnus, polisaharīdus, sāls jonus utt., kas traucē PCR reakciju.Kas prasa, lai reakcijas sistēmā esošajai nukleīnskābes polimerāzei un PCR maisījumam būtu lieliska pretestība un pielāgošanās spēja, lai nodrošinātu fermentu aktivitāti un replikācijas precizitāti sarežģītos apstākļos.

Piektkārt, audu paraugs, kas mērķēts ar Direct PCR tehnoloģiju bez nukleīnskābju bagātināšanas apstrādes un veidnes daudzuma, ir ļoti mazs, tāpēc reakcijas sistēmai ir jābūt ārkārtīgi augstai jutībai un amplifikācijas efektivitātei.