Izcilā PCR reakcijas iezīme ir tās lielā pastiprināšanas jauda un ārkārtīgi augsta jutība.Lai uzlabotu PCR veiktspēju un noteikšanas efektivitāti, mēs esam apņēmušies uzlabot PCR pastiprināšanas spēju un noteikšanas jutīgumu, taču galvassāpes ir eksperimenta procesā.Bieži rodas viltus pozitīvi rezultāti, un ļoti neliels parauga savstarpējas inficēšanās vai PCR produkta piesārņojuma daudzums eksperimentā var izraisīt viltus pozitīvus rezultātus.
Pieci PCR produktu piesārņojuma veidi
PCR piesārņojumam ir daudz iemeslu, kurus var aptuveni iedalīt šādās kategorijās:
Paraugu piesārņojumu galvenokārt izraisa parauga savākšanas konteinera piesārņojums, vai arī, kad paraugs tiek novietots, tas ir iztecējis no konteinera vaļīgas noslēgšanas dēļ, vai arī paraugs ir pielipis konteinera ārpusei, kas izraisa savstarpēju piesārņojumu;Piesārņojums izraisa piesārņojumu starp paraugiem;daži mikrobu paraugi, īpaši vīrusi, var izplatīties ar aerosoliem vai veidot aerosolus, izraisot savstarpēju piesārņojumu.
Galvenais iemesls ir tas, ka PCR reaģentu sagatavošanas laikā parauga pistole, tvertne, divreiz destilēts ūdens un citi šķīdumi tiek piesārņoti ar PCR nukleīnskābes šablonu.
Molekulārās bioloģijas laboratorijās un dažās laboratorijās, kurās kā pozitīvas kontroles izmanto klonētas plazmīdas, izplatīta ir arī klonētu plazmīdu piesārņojuma problēma.Tā kā klonēšanas plazmīdas saturs tilpuma vienībā ir diezgan augsts, un attīrīšanas procesā ir nepieciešams vairāk instrumentu un reaģentu, un plazmīda dzīvās šūnās, visticamāk, būs piesārņota dzīvu šūnu spēcīgās augšanas un vairošanās spējas dēļ.
Pastiprināto produktu piesārņojums ir visizplatītākā piesārņojuma problēma PCR reakcijās.Tā kā PCR produkta kopiju daudzums ir liels (parasti 1013 kopijas/ml), kas ir daudz lielāks par PCR noteikšanas kopiju skaita robežu, ļoti mazs PCR produkta piesārņojuma daudzums var izraisīt viltus pozitīvus rezultātus.
Aerosola piesārņojums ir visticamākais PCR produktu piesārņojuma veids, un to ir arī visvieglāk neievērot.To veido berze starp šķidruma virsmu un gaisu.Parasti aerosola piesārņojums var veidoties, atverot vāku, kad paraugs tiek aspirēts vai pat tad, ja reakcijas caurule tiek enerģiski sakrata.Pēc aprēķiniem, aerosola daļiņā var būt 48 000 eksemplāru, tāpēc tās radītais piesārņojums ir problēma, kurai jāpievērš īpaša uzmanība.
Jo īpaši testēšanas laboratorijas bieži izmanto vienu un to pašu primeru pāri, lai pārbaudītu noteiktu gēnu.Laika gaitā laboratorijas telpās notiks liels PCR produkta piesārņojums.Kad šāds piesārņojums ir noticis, ir grūti to īsā laikā novērst.
Pirmajiem trim piesārņojuma veidiem mēs varam izmantot efektīvus līdzekļus, lai izvairītos no tā, bet PCR produktu radīto piesārņojumu ir grūti novērst, īpaši nestandarta PCR laboratoriju celtniecībā.PCR procesā, kad pipetes gals iesūc un izpūš šķidrumu un tiek atvērts PCR caurules vāks, veidosies aerosols.DNS molekulas, ko pārnēsā aerosols (vienā aerosolā var būt desmitiem tūkstošu DNS), ir grūti likvidēt, jo tās peld gaisā.Kad tiks ieviesta nākamā PCR eksperimentu kārta, neizbēgami parādīsies kļūdaini pozitīvi rezultāti.
Kā parādīts zemāk esošajā attēlā, negatīvā kontrole arī pastiprināja atbilstošo interesējošo joslu:
Šeit ir iekļauta šī jautājuma pirmā daļa par PCR piesārņojumu un novēršanu.Nākamais numurs parādīs jums otro daļu "PCR produktu piesārņojuma novēršana", tāpēc sekojiet līdzi jaunumiem!
Izsūtīšanas laiks: 2017. gada 25. jūlijs
