Izveidojiet PCR eksperimenta SOP, lai standartizētu eksperimenta personāla uzvedību.
Eksperimentētājs stingri ievēro darbības procedūras un samazina PCR piesārņojumu, ko var izraisīt cilvēka faktori, vai novērš piesārņojuma rašanos.Turklāt eksperimentētājam jābūt atbilstošām profesionālajām zināšanām un prasmēm, tai skaitā prasmēm darbināt saistīto iekārtu, noskaidrot visu darba procesu, apgūt piesārņojuma apstrādes metodes un laboratorijas kvalitātes kontroles metodes, kā arī pareizi interpretēt testa rezultātus.
Izveidojiet standarta PCR laboratoriju.
PCR laboratorija principā ir sadalīta četrās jomās, proti, reaģentu sagatavošanas zonā, paraugu apstrādes zonā, amplifikācijas zonā un amplifikācijas produktu analīzes zonā.Pirmie divi apgabali ir pirmspastiprināšanas zonas, bet pēdējie divi apgabali ir apgabali pēc pastiprināšanas.Pirmspastiprināšanas zona un pēcpastiprināšanas zona ir stingri jānodala.Eksperimentālie materiāli, reaģenti, ierakstīšanas papīrs, pildspalvas, tīrīšanas materiāli utt. var plūst tikai no pirmspastiprināšanas zonas uz pēcpastiprināšanas zonu, tas ir, no reaģenta sagatavošanas zonas → parauga apstrādes zonas → amplifikācijas zonas → amplifikācijas produkta analīzes zonas, un tie nedrīkst plūst atpakaļ.Gaisa plūsmai laboratorijā arī jāplūst no pirmspastiprināšanas zonas uz pēcpastiprināšanas zonu, nevis jāplūst atpakaļ.Ideālais PCR laboratorijas dizains ir parādīts zemāk:
A attēls: Ideāls PCR laboratorijas iestatīšanas režīms ar negatīvu spiedienu bufertelpā
B attēls: Ideāls PCR laboratorijas iestatīšanas režīms ar pozitīvu spiedienu bufertelpā
PCR laboratorijas iestatīšanas diagrammām, kas norādītas A un B attēlā, vajadzētu būt ideālākam iestatīšanas režīmam, un laboratorija ar nosacījumiem var atsaukties uz šo režīmu projektēšanai.Parastām laboratorijām ir ieteicams atdalīt PCR amplifikācijas zonu un produkta analīzes zonu, un vāka atvērums ir pēc iespējas jāsamazina parauga sagatavošanas zonā un PCR amplifikācijas zonā.Atcerieties: produktus un eksperimentālos materiālus produktu analīzes zonā ir stingri aizliegts vest uz paraugu sagatavošanas zonu un PCR amplifikācijas zonu.
Ja laboratorija veic tikai PCR noteikšanu un identifikāciju, ieteicams izmantot fluorescējošu kvantitatīvo PCR, nevis parasto PCR.
Fluorescences kvantitatīvās PCR noteikšanas rezultātus var savākt un analizēt ar fluorescences signāliem, tāpēc pēc reakcijas nav nepieciešams atvērt vāku elektroforēzei, kas ļauj izvairīties no PCR produktu piesārņojuma, ko izraisa reakcijas produktu noplūde, veidojot aerosolus.Ja palielināsiet vāciņu atvērumu skaitu gēla elektroforēzes iekraušanas posmā, iespējams, radīsies aerosola piesārņojums.Ieteicams veicināt kvantitatīvās PCR piemērošanu un pakāpeniski aizstāt kvalitatīvo PCR.
PCR reakcijai tiek izmantota UNG anti-PCR produktu piesārņojuma sistēma.
Sistēma izmanto dUTP, nevis dTTP.Pēc PCR reakcijas visi PCR produkti (DNS fragmenti) tiek iekļauti dUTP;nākamajā PCR reakcijas kārtā sistēmai pievienoto UNG enzīmu pirms PCR 5 minūtes inkubē 37°C temperatūrā, kas var specifiski noārdīt visus DNS fragmentus, kas satur dUTP, un pēc tam veikt PCR reakciju.Tas var pilnībā novērst PCR produktu izraisīto aerosola piesārņojumu.Efekts ir parādīts zemāk esošajā attēlā:
Piezīme: tiešajai PCR sērijai varat izvēlēties Foregene anti-PCR produktu piesārņojuma sistēmas sērijas produktus.Ieteikt
Laboratorijām, kas veic liela mēroga genotipu testēšanu, papildus saprātīgu laboratoriju izveidei ir ļoti ieteicams reaģentu testēšanai izmantot UNG anti-PCR produktu piesārņojuma sistēmu.
Atgādinājums: šīs sistēmas izmantošana nevar novērst jau izraisīto PCR produkta piesārņojumu.Tāpēc attiecīgā testa sākumā ir jāizmanto UNG sistēma, un PCR amplifikācijai jāizmanto UNG sistēma, lai novērstu PCR produktu inficēšanos. Viltus pozitīvi.
Veicot liela mēroga testēšanu, ieteicams izmantot Foregene Direct PCR-UNG sistēmu, piemēram:
Plant Leaf Direct PCR komplekts-UNG；
Plant Seed Direct PCR komplekts-UNG；
Animal Tissue Direct PCR komplekts-UNG；
Mouse Tail Direct PCR komplekts-UNG；
Zebra Fish Direct PCR komplekts-UNG.
Šī komplektu sērija no Foregenevar ne tikai ātri un plašā mērogā veikt PCR noteikšanu, bet arī efektīvi novērst un kontrolēt PCR produktu piesārņojumu.
Izlikšanas laiks: 19.03.2021
