Molekulārās diagnostikas tehnoloģijā tiek izmantotas molekulārās bioloģijas metodes, lai noteiktu cilvēka ķermeņa un dažādu patogēnu ģenētiskā materiāla ekspresiju un struktūru, lai sasniegtu slimību prognozēšanas un diagnosticēšanas mērķi.

Pēdējos gados, pilnveidojot un atkārtojot molekulārās diagnostikas tehnoloģiju, molekulārās diagnostikas klīniskais pielietojums ir kļuvis arvien plašāks un padziļinātāks, un molekulārās diagnostikas tirgus ir iegājis straujas attīstības periodā.

Autors apkopo tirgū izplatītās molekulārās diagnostikas tehnoloģijas, un tās ir sadalītas trīs daļās: pirmajā daļā ir iepazīšanās ar PCR tehnoloģiju, otrajā daļā ir iepazīšanās ar nukleīnskābju izotermiskās amplifikācijas tehnoloģiju, bet otrajā daļā – sekvencēšanas tehnoloģija.

01

I daļa: PCR tehnoloģija

PCR tehnoloģija

PCR (polimerāzes ķēdes reakcija) ir viena no in vitro DNS amplifikācijas tehnoloģijām ar vairāk nekā 30 gadu vēsturi.

PCR tehnoloģiju 1983. gadā aizsāka Karijs Mulliss no Setusas, ASV.Mullis iesniedza pieteikumu PCR patentam 1985. gadā un tajā pašā gadā publicēja pirmo PCR akadēmisko rakstu par zinātni.Mullis ieguva Nobela prēmiju ķīmijā 1993. gadā.

PCR pamatprincipi

PCR var pastiprināt mērķa DNS fragmentus vairāk nekā vienu miljonu reižu.Princips ir tāds, ka DNS polimerāzes katalīzes laikā kā veidne tiek izmantota sākotnējā DNS virkne, un kā pagarinājuma sākumpunkts tiek izmantots īpašs primer.To atkārto in vitro, izmantojot tādas darbības kā denaturācija, atkausēšana un pagarināšana.DNS meitas virknes process, kas komplementārs ar vecāku virknes veidnes DNS.

Standarta PCR process ir sadalīts trīs posmos:

1. Denaturēšana: izmantojiet augstu temperatūru, lai atdalītu DNS dubultās virknes.Ūdeņraža saites starp DNS dubultvirknēm tiek pārrautas augstā temperatūrā (93-98°C).

2. Atkausēšana: pēc divpavedienu DNS atdalīšanas temperatūra tiek pazemināta, lai primer varētu saistīties ar vienpavedienu DNS.

3. Pagarinājums: DNS polimerāze sāk sintezēt komplementāras virknes gar DNS virknēm no primeriem, kas saistīti, kad temperatūra tiek pazemināta.Kad pagarinājums ir pabeigts, tiek pabeigts cikls, un DNS fragmentu skaits dubultojas.

Veicot šos trīs soļus 25-35 reizes, DNS fragmentu skaits pieaugs eksponenciāli.

PCR atjautība ir tāda, ka dažādiem mērķa gēniem var izveidot dažādus primerus, lai mērķa gēna fragmentus varētu pastiprināt īsā laika periodā.

Līdz šim PCR var iedalīt trīs kategorijās, proti, parastajā PCR, fluorescējošā kvantitatīvā PCR un digitālajā PCR.

Pirmā parastā PCR paaudze

Izmantojiet parastu PCR amplifikācijas instrumentu, lai pastiprinātu mērķa gēnu, un pēc tam izmantojiet agarozes gēla elektroforēzi, lai noteiktu produktu, var veikt tikai kvalitatīvu analīzi.

Pirmās paaudzes PCR galvenie trūkumi:

- Nosliece uz nespecifisku pastiprināšanos un viltus pozitīviem rezultātiem.

- Atklāšana aizņem ilgu laiku, un darbība ir apgrūtinoša.

- Var veikt tikai kvalitatīvu pārbaudi.

Otrās paaudzes fluorescences kvantitatīvā PCR

Fluorescences kvantitatīvā PCR (reālā laika PCR), kas pazīstama arī kā qPCR, tiek izmantota, lai uzraudzītu pastiprināto produktu uzkrāšanos, akumulējot fluorescējošos signālus, pievienojot fluorescējošas zondes, kas var norādīt reakcijas sistēmas gaitu, un lai novērtētu rezultātus, izmantojot fluorescences līkni, un to var izmantot ar Cq vērtību un standarta līkni.

Tā kā qPCR tehnoloģija tiek veikta slēgtā sistēmā, piesārņojuma iespējamība ir samazināta, un fluorescences signālu var kontrolēt kvantitatīvi, tāpēc tā ir visplašāk izmantotā klīniskajā praksē un ir kļuvusi par dominējošo tehnoloģiju PCR.

Fluorescējošās vielas, ko izmanto reāllaika fluorescējošajā kvantitatīvajā PCR, var iedalīt: TaqMan fluorescējošās zondes, molekulārās bākas un fluorescējošās krāsvielas.

1) TaqMan fluorescējošā zonde:

PCR amplifikācijas laikā tiek pievienota īpaša fluorescējoša zonde, vienlaikus pievienojot primeru pāri.Zonde ir oligonukleotīds, un abi gali ir attiecīgi marķēti ar reportiera fluorescējošu grupu un slāpētāja fluorescējošu grupu.

Kad zonde ir neskarta, fluorescējošo signālu, ko izstaro reportieru grupa, absorbē dzēšanas grupa;PCR amplifikācijas laikā Taq enzīma 5′-3′ eksonukleāzes aktivitāte sašķeļ un degradē zondi, padarot reportiera fluorescējošu grupu un dzēsēju. Fluorescējošā grupa tiek atdalīta, lai fluorescences uzraudzības sistēma varētu uztvert fluorescences signālu, tas ir, katru reizi, kad tiek veidota DNS molekula, tiek pastiprināta fluorescence, tiek pastiprināta DNS virkne, tiek pastiprināts signāls. ir pilnībā sinhronizēts ar PCR produkta veidošanos.

2) SYBR fluorescējošās krāsvielas:

PCR reakcijas sistēmā tiek pievienots SYBR fluorescējošās krāsas pārpalikums.Pēc tam, kad SYBR fluorescējošā krāsa ir nespecifiski iekļauta DNS dubultajā pavedienā, tā izstaro fluorescējošu signālu.SYBR krāsvielas molekula, kas nav iekļauta ķēdē, neizstaro fluorescējošu signālu, tādējādi nodrošinot fluorescējošu signālu. PCR produktu pieaugums ir pilnībā sinhronizēts ar PCR produktu pieaugumu.SYBR saistās tikai ar divpavedienu DNS, tāpēc kušanas līkni var izmantot, lai noteiktu, vai PCR reakcija ir specifiska.

3) Molekulārās bākas

Tā ir cilpas cilpas divkārši marķēta oligonukleotīdu zonde, kas veido apmēram 8 bāzu matadata struktūru 5 un 3 galos.Nukleīnskābju sekvences abos galos ir komplementāri savienotas, izraisot fluorescējošās grupas un slāpējošās grupas sasprindzinājumu.Aizveriet, tas neradīs fluorescenci.

Pēc PCR produkta ģenerēšanas atkausēšanas procesa laikā molekulārās bākas vidusdaļa tiek savienota pārī ar noteiktu DNS sekvenci, un fluorescējošais gēns tiek atdalīts no slāpētāja gēna, lai radītu fluorescenci.

Galvenie otrās paaudzes PCR trūkumi:

Joprojām trūkst jutīguma, un paraugu ar zemu kopiju noteikšana nav precīza.

Ir fona vērtības ietekme, un rezultāts ir jutīgs pret traucējumiem.

Trešās paaudzes digitālā PCR

Digitālā PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) aprēķina mērķa sekvences kopiju skaitu, izmantojot beigu punkta noteikšanu, un var veikt precīzu absolūto kvantitatīvo noteikšanu, neizmantojot iekšējās kontroles un standarta līknes.

Digitālā PCR izmanto beigu punktu noteikšanu un nav atkarīga no Ct vērtības (cikla sliekšņa), tāpēc digitālo PCR reakciju mazāk ietekmē amplifikācijas efektivitāte, un tiek uzlabota tolerance pret PCR reakcijas inhibitoriem ar augstu precizitāti un reproducējamību.

Augstas jutības un augstas precizitātes īpašību dēļ PCR reakcijas inhibitori to viegli neiejaucas, un tas var sasniegt patiesu absolūto kvantitatīvo noteikšanu bez standarta produktiem, kas ir kļuvis par pētniecības un pielietojuma karsto punktu.

Atbilstoši dažādām reakcijas vienības formām to var iedalīt trīs veidos: mikrofluidiskās, mikroshēmas un pilienu sistēmas.