Ct vērtība ir vissvarīgākā fluorescējošās kvantitatīvās PCR rezultātu prezentācijas forma.To izmanto, lai aprēķinātu gēnu ekspresijas atšķirības vai gēnu kopiju skaitu.Tātad, kāda ir fluorescences kvantitatīvās noteikšanas Ct vērtība, kas tiek uzskatīta par saprātīgu?Kā nodrošināt efektīvu Ct vērtības diapazonu?
Kas ir Ct vērtība?
qPCR pastiprināšanas procesa laikā atbilstošais pastiprināšanas ciklu skaits (Cycle Threshold), kad pastiprinātā produkta fluorescences signāls sasniedz iestatīto fluorescences slieksni.C apzīmē ciklu un T apzīmē slieksni.Vienkārši sakot, Ct vērtība ir ciklu skaits, kas atbilst tam, kad sākotnējā veidnes amplifikācija sasniedz noteiktu produkta daudzumu qPCR.Tā sauktais “noteikts produkta daudzums” tiks sīkāk izskaidrots vēlāk.
Ko dara Ct vērtība?
1.Saistība starp eksponenciālo pastiprinājumu, šablona daudzumu un Ct vērtību
Ideālā gadījumā gēni qPCR tiek uzkrāti ar eksponenciālu pastiprināšanu pēc noteikta ciklu skaita.Attiecība starp pastiprināšanas ciklu skaitu un produktu daudzumu ir šāda: Pastiprinātā produkta daudzums = sākotnējais šablona daudzums × (1+En) ciklu skaits.Tomēr qPCR reakcija ne vienmēr ir ideālā situācijā.Kad pastiprinātā produkta daudzums sasniedz “noteiktu produkta daudzumu”, ciklu skaits šajā laikā ir Ct vērtība, un tas ir eksponenciālās pastiprināšanas periodā.Attiecība starp Ct vērtību un sākuma veidnes apjomu: Pastāv lineāra sakarība starp veidnes Ct vērtību un veidnes sākuma kopijas numura logaritmu.Jo augstāka ir sākotnējā šablona koncentrācija, jo mazāka ir Ct vērtība;jo zemāka ir sākotnējā šablona koncentrācija, jo lielāka ir Ct vērtība.
2.Amplifikācijas līkne, fluorescences slieksnis un noteikts PCR produkta daudzums
qPCR pastiprināšanas produkta daudzums tiek tieši parādīts fluorescējoša signāla veidā, tas ir, pastiprināšanas līknē.Agrīnā PCR stadijā amplifikācija notiek ideālos apstākļos, ciklu skaits ir mazs, produkta uzkrāšanās ir neliela, un fluorescences līmeni nevar skaidri atšķirt no fluorescences fona.Pēc tam fluorescence palielinās un nonāk eksponenciālajā fāzē.PCR produkta daudzumu var noteikt noteiktā brīdī, kad PCR reakcija ir tikai eksponenciālā fāzē, ko var izmantot kā “noteiktu produkta daudzumu”, un no tā var secināt sākotnējo veidnes saturu.Tāpēc fluorescences signāla intensitāte, kas atbilst noteiktam produkta daudzumam, ir fluorescences slieksnis.
PCR vēlīnā stadijā amplifikācijas līkne vairs neuzrāda eksponenciālu pastiprināšanos un nonāk lineārajā fāzē un plato fāzē.
3.Ct vērtību reproducējamība
Kad PCR cikls sasniedz Ct vērtības cikla numuru, tas tikko ir ienācis patiesajā eksponenciālās amplifikācijas periodā.Šobrīd mazā kļūda nav pastiprināta, tāpēc Ct vērtības reproducējamība ir lieliska, tas ir, viena un tā pati veidne tiek pastiprināta dažādos laikos vai dažādās caurulēs vienlaikus.Pastiprināšana, iegūtā Ct vērtība ir nemainīga.
1. Pastiprināšanas efektivitāte En
PCR amplifikācijas efektivitāte attiecas uz efektivitāti, ar kādu polimerāze pārvērš pastiprināmo gēnu amplikonā.Pastiprināšanas efektivitāte, kad viena DNS molekula tiek pārveidota divās DNS molekulās, ir 100%.Pastiprināšanas efektivitāti parasti izsaka kā En.Lai atvieglotu turpmāko rakstu analīzi, īsumā tiek iepazīstināti ar faktoriem, kas ietekmē pastiprināšanas efektivitāti.
| Ietekmējošie faktori | skaidrojums | Kā spriest? |
| A. PCR inhibitori | 1. Veidnes DNS satur vielas, kas inhibē PCR reakciju, piemēram, olbaltumvielas vai mazgāšanas līdzekļus.2. cDNS pēc reversās transkripcijas satur lielu veidņu RNS vai RT reaģenta komponentu koncentrāciju, kas var arī kavēt turpmāko PCR reakciju. | 1. Vai ir piesārņojums, var spriest, izmērot attiecību A260/A280 un A260/A230 vai RNS elektroforēzi.2. Vai cDNS pēc reversās transkripcijas ir atšķaidīta atbilstoši noteiktai attiecībai. |
| B. Nepareizs gruntējuma dizains | Gruntskrāsas nav atlaidinātas efektīvi | Pārbaudiet, vai gruntskrāsās nav primer-dimeru vai matadatas, neatbilstību un dažkārt aptverošu intronic dizainu. |
| C. Nepareizs PCR reakcijas programmas dizains | 1. Gruntskrāsas nevar efektīvi atkausēt2. Nepietiekama DNS polimerāzes izdalīšanās 3. Ilgstoši augstas temperatūras DNS polimerāzes aktivitāte pazeminājās | 1. Atlaidināšanas temperatūra ir augstāka par gruntskrāsu TM vērtību2. Pirmsdenaturācijas laiks ir pārāk īss 3. Katra reakcijas procedūras posma laiks ir pārāk garš |
| D. Nepietiekama reaģentu sajaukšana vai pipetēšanas kļūdas | Reakcijas sistēmā PCR reakcijas komponentu lokālā koncentrācija ir pārāk augsta vai nevienmērīga, kā rezultātā PCR amplifikācija notiek neeksponenciāli. | |
| E. Amplikona garums | Amplikona garums ir pārāk garš, pārsniedz 300 bp, un pastiprināšanas efektivitāte ir zema | Pārbaudiet, vai amplikona garums ir no 80 līdz 300 bp |
| F. qPCR reaģentu ietekme | DNS polimerāzes koncentrācija reaģentā ir zema vai jonu koncentrācija buferšķīdumā nav optimizēta, kā rezultātā Taq enzīma aktivitāte nesasniedz maksimumu | Pastiprināšanas efektivitātes noteikšana pēc standarta līknes |
2.Ct vērtību diapazons
Ct vērtības svārstās no 15-35.Ja Ct vērtība ir mazāka par 15, tiek uzskatīts, ka pastiprinājums ir bāzes perioda diapazonā un fluorescences slieksnis nav sasniegts.Ideālā gadījumā pastāv lineāra sakarība starp Ct vērtību un veidnes sākotnējās kopijas numura logaritmu, tas ir, standarta līkni.Izmantojot standarta līkni, kad amplifikācijas efektivitāte ir 100%, aprēķinātā Ct vērtība gēna vienas kopijas skaita kvantitatīvai noteikšanai ir aptuveni 35. Ja tas ir lielāks par 35, veidnes sākotnējais kopijas numurs teorētiski ir mazāks par 1, ko var uzskatīt par bezjēdzīgu.
Dažādiem gēnu Ct diapazoniem, ņemot vērā atšķirības gēnu kopiju skaitā un amplifikācijas efektivitātes sākotnējā veidnes daudzumā, ir nepieciešams izveidot gēna standarta līkni un aprēķināt gēna lineāro noteikšanas diapazonu.
3.Ct vērtības ietekmējošie faktori
No attiecības starp pastiprināšanas ciklu skaitu un produkta daudzumu: pastiprinātā produkta daudzums = sākotnējās veidnes daudzums × (1 + En) cikla numurs, var redzēt, ka ideālos apstākļos sākotnējās veidnes un En daudzums negatīvi ietekmēs Ct vērtību.Veidnes kvalitātes vai pastiprināšanas efektivitātes atšķirības dēļ Ct vērtība būs pārāk liela vai pārāk maza.
4.Ct vērtība ir pārāk liela vai pārāk maza
Izlikšanas laiks: 22.02.2023
