RT-qPCR ir molekulārās bioloģijas pamateksperiments, un visiem tas ir jāzina.Tas galvenokārt ietver trīs posmus: RNS ekstrakciju, reverso transkripciju cDNS un reāllaika fluorescējošu kvantitatīvo PCR.Tas nepalīdz, kas notiek?Visticamāk, ka ir problēma arreversās transkripcijas eksperiments!Lai gan šķiet, ka reversās transkripcijas eksperimentam ir jāpievieno tikai RNS, dNTP, primeri unreversā transkriptāzeuz centrifūgas cauruli un labi samaisa, taču faktiskajā darbības procesā joprojām ir daudz detaļu, kurām jāpievērš uzmanība.Uzzināsim par to!

Kā spriest par RNS kvalitāti?
Lai iegūtu cDNS, RNS kvalitāte ir kritiska!RNS kvalitāti var noteikt galvenokārt no diviem aspektiem:
(1) RNS integritāte:RNS integritāti var pārbaudīt ar agarozes gēla elektroforēzi. Ņemot par piemēru eikariotus, pilnīgai kopējai RNS ir trīs skaidras joslas, molekulmasa no lielas līdz mazai ir 28S, 18S un 5S, un 28S ir divreiz spilgtāka par 18S;ja var redzēt trīs joslas, bet joslu tips ir izplūdis vai difūzija nozīmē, ka RNS ir daļēji degradēta.Šobrīd, lūdzu, nekavējoties veiciet reversās transkripcijas reakciju un atbilstoši palieliniet veidnes ievadi;ja ir redzama tikai josla ar mazu molekulmasu vai josla nav redzama, RNS ir pilnībā noārdījusies un ir atkārtoti jāizņem.Agilent 2100 norāda RNS integritāti ar pīķu diagrammu un RIN vērtību.Ja nukleīnskābe ir neskarta, elektroferogrammas bāzes līnija ir plakana;ja nukleīnskābe ir stipri noārdījusies, bāzes līnija ir nevienmērīga un parādās vairāk noārdīšanās maksimumu;RIN vērtība atspoguļo RNS integritāti diapazonā no 0 līdz 10, jo lielāka vērtība, jo labāka ir RNS kvalitāte.Nu, jo augstāka ir pabeigtības pakāpe.
(2) RNS tīrība:OD260/280 attiecību var noteikt ar UV spektrofotometriju.Ja OD260/280 attiecība ir no 1,9 līdz 2,1, tīrība ir ļoti laba.
Atlikušā genoma DNS var novest pie neprecīziem kvantitatīviem rezultātiem
Kad RNS tiek ekstrahēta, iegūtā RNS var tikt sajaukta ar genoma DNS (gDNS), kas nav iztīrīta.Tāpēc cDNS pēc reversās transkripcijas arī tiks sajaukts argDNS.Lejas straumes laikāqPCRreakcija,cDNSun gDNS var tikt pastiprināti vienlaicīgi, kā rezultātā tiek iegūta salīdzinoši neliela CT vērtība, tāpēc rezultāti var būt neobjektīvi.
Tātad, kas mums jādara šajā situācijā?Foregeneiesaka:
(1) Veiciet apgrieztās RNS genoma tīrīšanu, ko var noņemt ar kolonnas ekstrakciju RNS ekstrakcijas laikā;
(2) Ekstrahēto RNS apstrādā ar DNāziI , bet pārtrauc to ar EDTA;
apgrieztās transkripcijas reaģentiar genoma attīrīšanas moduļiem;

Kā izvēlēties primerus reversajai transkripcijai?
Reversās transkripcijas primeri ietekmē arī reversās transkripcijas reakcijas iznākumu.Jūs varat izvēlēties nejaušus primerus, Oligo dT vai gēnu specifiskus primerus reversajai transkripcijai atbilstoši eksperimenta konkrētajiem apstākļiem:
(1) Īpaši atšifrējumi: ieteicami gēniem specifiski praimeri;
(2) Gari fragmentu atšifrējumi: ieteicami Oligo dT/gēnu specifiskie praimeri;
(3) Garo segmentu atšifrējumu iekšējie fragmenti: gēniem specifiski praimeri/ izlases praimeri/gadījuma praimeri + Oligo dT.Ja tiek veikts nākamais qPCR eksperiments, Oligo dT nevar izmantot vienu pašu, jo tikai Oligo dT lietošana var izraisīt 3′ gala novirzi, izraisot neprecīzus qPCR eksperimenta rezultātus;
(4) miRNS: Var izmantot kāta cilpas gruntējumus vai astes gruntējumus.

Cik reizes reversās transkripcijas produkta cDNS ir jāatšķaida kvantitatīvai noteikšanai?
Pēc reversās transkripcijas produkta cDNS iegūšanas ļoti svarīgi ir tas, cik reizes cDNS jāatšķaida qPCR eksperimentiem.Ja cDNS koncentrācija ir pārāk augsta vai pārāk zema, var tikt ietekmēta amplifikācijas efektivitāte.Vai ir iespējams izmērīt cDNS koncentrāciju, un kā tas būtu jādara?
(1) Reversās transkripcijas produkta cDNS koncentrāciju nevar izmērīt, jo papildus cDNS produktam reversās transkripcijas produkts satur arī reversās transkripcijas atlikušo buferšķīdumu, reverso transkriptāzi, praimerus u.c., kas traucēs koncentrācijas mērījumu rezultātus un izraisīs OD260/280, OD260/23 iznākuma koeficients neatbilst patiesībai.Šajā laikā daži draugi teiks, tad es mērīšu koncentrāciju pēc attīrīšanas;šeit Foregene atgādina, ka cDNS nav ieteicams attīrīt, jo apvērsumā iegūtās cDNS garums ir atšķirīgs, un īsā cDNS attīrīšanā tiks zaudēta.
(2) Tātad, ko darīt?Pirms qPCR eksperimenta cDNS atšķaidīšanas gradientu var noteikt, izmantojot iepriekšēju eksperimentu .Piemēram: izmantojiet cDNS izejas šķīdumu, 10-kārtīgu atšķaidījumu un 100-kārtīgu atšķaidījumu kā veidnes qPCR eksperimentiem un atlasiet atšķaidīšanas koeficientu ar CT vērtību diapazonā no 18 līdz 28.

Kā miRNS vajadzētu reversi transkribēt?
miRNS ir vienpavedienu mazas molekulas RNS, kuras izmērs ir aptuveni 22 nt, kas nekodē proteīnu.Tā kā parastā qPCR metode ir maza, to ir grūti tieši kvantitatīvi noteikt, tāpēc bieži vien ir nepieciešams pagarināt miRNS;MiRNS parasti izmantotās reversās transkripcijas metodes ietver cilmes cilpas metodi un astes metodi.
Stumbra cilpas metode ir miRNS paplašināšana, pievienojot cilmes cilpas primerus.Šai noteikšanas metodei ir augstāka jutība un specifiskums, taču noteikšanas caurlaidspēja ir zema.Viena reversā transkripcija var noteikt tikai vienu miRNS un iekšējo atsauci;astes pievienošanas metode sastāv no diviem. To papildina divu enzīmu, kas ir PolyA polimerāze un reversā transkriptāze, kopīga darbība.PolyA polimerāze ir atbildīga par PolyA astes pievienošanu miRNS, lai palielinātu tās garumu, un reversā transkriptāze veic reversās transkripcijas reakciju.Šai metodei ir augsta noteikšanas caurlaidspēja, un tā var noteikt vairākas miRNS un iekšējās atsauces vienā reversajā transkripcijā, taču cilmes cilpas metodē jutīgums un specifiskums ir zems.