PCR, vairākas PCR, In situ PCR, Reversā PCR, RT-PCR, qPCR (1)–PCR

Mēs noskaidrosim dažādu PCR jēdzienus, darbības un detaļas

Ⅰ. PCR

Polimerāzes ķēdes reakcija, saukta par PCR, ir molekulāri bioloģiskā tehnoloģija, ko izmanto, lai palielinātu specifiskus DNS fragmentus.To var uzskatīt par īpašu DNS replikāciju in vitro.DNS polimerāze (DNS polimerāze I) tika atklāta jau 1955. gadā, un Klenovas E. Coli fragmentu, kam ir eksperimentāla vērtība un praktiskums, atklāja doktors H. Klenovs 20. gadsimta 70. gadu sākumā, taču, tā kā šis enzīms necieš temperatūru, augsta temperatūra var to deģenerēt, tāpēc neatbilst augstas temperatūras polimerāzes ķēdes reakcijai.Mūsdienās izmantotie enzīmi (saukta par Taq polimerāzi) tika izolēti no Thermus aquaticus, karstavotu baktērijas 1976. gadā. Tā īpašība ir tā, ka tā var izturēt augstu temperatūru un ir ideāls enzīms, taču to plaši izmanto pēc 1980. gadiem.Sākotnējā PCR primitīvā prototipa sākotnējā koncepcija ir līdzīga gēnu labošanai un kopēšanai, ko 1971. gadā ierosināja Dr. KJell Kleppe. Viņš publicēja pirmo vienkāršo un īslaicīgo gēna kopiju (līdzīgi PCR pirmajām divām cikla reakcijām).Mūsdienās izstrādāto PCR izstrādāja Dr. Kary B. Mullis 1983. gadā. Dr. Mullis tajā gadā apkalpoja PE uzņēmumus, tāpēc PE ir īpašs statuss PCR nozarē.Dr. Mullis oficiāli publicēja pirmo saistīto rakstu ar Saiki un citiem 1985. gadā. Kopš tā laika PCR tiek izmantots tūkstošiem jūdžu dienā, un var teikt, ka saistīto rakstu kvalitāte padara daudzas citas pētniecības metodes nebaudāmas.Pēc tam PCR tehnoloģija tiek plaši izmantota bioloģiskajos zinātniskajos pētījumos un klīniskajos lietojumos, kļūstot par vissvarīgāko molekulārās bioloģijas pētījumu tehnoloģiju.Mullis ieguva arī 1993. gada Nobela prēmiju ķīmijā.

PCRPrincips

PCR tehnoloģijas pamatprincips ir līdzīgs dabiskajam DNS replikācijas procesam, un tā specifika ir atkarīga no oligonukleotīda praimera, kas ir komplementārs ar abiem mērķa sekvences galiem.PCR sastāv no deģenerācijas-atkvēlināšanas-pagarināšanas trīs pamata reakcijas posmiem: ①Veidnes DNS deģenerācija: pēc tam, kad DNS veidne ir uzkarsēta līdz aptuveni 93°C noteiktu laika periodu, duālais DNS šķīdums divķēžu DNS, kas veidojas, PCR pastiprinot veidnes DNS aiziešanu, padara to par vienu ķēdi, lai sagatavotu nākamās kārtas reakcijai.②Veidnes DNS un praimera atkausēšana (savienojums): pēc tam, kad veidnes DNS ir uzkarsēta un deģenerēta vienā ķēdē, temperatūra pazeminās līdz aptuveni 55°C.Praimera un veidnes DNS vienas ķēdes komplementārā secība.③ Primera pagarinājums: DNS veidne – praimera saistīšanās pamatā ir TaqDNA polimerāzes darbība, un dNTP kā reakcijas izejmateriāls.Saglabājiet replikācijas principu, sintezējiet jaunu daļēji rezervētu kopiju ķēdi, kas papildina veidnes DNS ķēdi, un atkārtojiet cikla deģenerācijas-atkvēlināšanas-paplašināšanas trīs procesus, lai iegūtu vairāk “daļēji rezervētas kopiju ķēdes”, un šī jaunā ķēde atkal ir pieejama. Kļūsti par veidni nākamajam ciklam.Cilpas pabeigšana aizņem 2-4 minūtes, mērķa gēnu var pastiprināt vairākus miljonus reižu 2-3 stundu laikā.

StandartaPCRReakcijas sistēma

Pieci PCR reakcijas elementi

PCR reakcijā galvenokārt ir iesaistītas piecu veidu vielas, proti, primer, ferments, dNTP, šablons un buferis (nepieciešams Mg2+).[PCR procedūra]

Standarta PCR process ir sadalīts trīs posmos

1. DNS deģenerācija (90°C-96°C): Divu ķēžu DNS šabloni termiskā iedarbībā, ūdeņraža saites pārtrūkst, veidojot vienas ķēdes DNS.

2. Atkausēšana (25℃ -65℃): Sistēmas temperatūra tiek pazemināta, primer tiek apvienots ar DNS šablonu, veidojot lokālu divķēdi.

3. Pagarinājums (70℃ -75℃): Taq enzīma iedarbībā (apmēram 72°C, vislabākā aktivitāte) dNTP tiek izmantots kā izejmateriāls, stiepjas no praimera 5′ gala → 3′ gala, sintēze un veidne papildina viena otru DNS ķēdi.

Katrs cikls tiek denaturēts, atkvēlināts un pagarināts, dubultojot DNS saturu.Pašlaik īsā amplifikācijas apgabala dēļ dažus PCR var replicēt ļoti īsā laikā, pat ja Taq enzīma aktivitāte nav optimāla, tāpēc to var mainīt uz diviem posmiem, tas ir, atkvēlināšanu un pagarināšanu var veikt 60°C-65°C vienlaicīgi.Lai samazinātu pacelšanas un dzesēšanas procesu un uzlabotu reakcijas ātrumu.

PCR reakcijas īpašības

● Augsta specifika

PCR atbildes specifiskie izšķirošie faktori ir: ①Īpaša praimera un šablona DNS kombinācija.②Bāzes savienošanas pārī princips.③ TaqDNA polimerāzes sintēzes reakcijas lojalitāte.④Mērķa gēna specifika un konservativitāte.

Galvenais ir pareiza gruntskrāsu un veidņu kombinācija.Primera un veidnes saistīšana un gruntēšanas ķēdes pagarināšana ir balstīta uz sārmainās bāzes saskaņošanas principu.Polimerāzes sintēzes reakciju lojalitāte un Taq DNS polimerāzes izturība pret augstu temperatūru, lai izveidotu veidnes un praimera saistīšanos (savienojumu) reakcijā, var tikt veikta augstākā temperatūrā.Kombinācijas specifika ir ievērojami palielināta.Klips var saglabāt augstu pareizības pakāpi.Izvēloties mērķa ģenētisko reģionu ar augstu konservativitāti un augstu konservativitāti, tā specifika ir augstāka.

● Augsta jutība

PCR produktu ražošanas apjoms tiek palielināts ar indeksu, kas var paplašināt Picker sākuma šablonu (PG=10-12), lai palielinātu mikrokontrollera līmeni līdz mikrogramu līmenim (μg= -6).Mērķa šūnas var noteikt no 1 miljona šūnu;vīrusu noteikšanā PCR jutība var sasniegt 3 RFU (tukšas vietas veido vienības);minimālais noteikšanas līmenis baktēriju zinātnē ir 3 baktērijas.

● Vienkārši un ātri

PCR atspoguļojumā tiek izmantota augstas temperatūras Taq DNS polimerāze, kas vienā reizē pievieno reakcijas šķīdumu, tas ir, deģenerācijas-atlaidināšanas-paplašināšanas reakciju uz DNS amplifikācijas šķīdumu un ūdens vannas katlu.Parasti amplifikācijas reakcija tiek pabeigta 2 līdz 4 stundu laikā.Papildinātos produktus parasti analizē ar elektrisko zobenu, un tiem nav jāizmanto izotopi, nav radioaktīvā piesārņojuma un vienkārša reklamēšana.

● Parauga tīrība ir zema

Nav nepieciešams atdalīt vīrusus vai baktērijas un kultivēt šūnas.DNS neapstrādātus produktus un RNS var izmantot kā pastiprinātājus.DNS amplifikācijas noteikšanu var izmantot tieši, izmantojot klīniskos paraugus, piemēram, asinis, ķermeņa šķidrumu, klepus mazgāšanas šķidrumu, matus, šūnas un dzīvos audus.

PCRkopīgas problēmas

● Viltus negatīvs, nav pastiprinātu joslu

PCR reakcijas galvenie posmi ietver: ① šablonu nukleīnskābju sagatavošanu, ② praimeru kvalitāti un specifiku, ③ fermentu kvalitāti ④ PCR cikla apstākļus.Iemesla atrašana ir arī jāanalizē un jāizpēta iepriekšminētajām saitēm.

Veidnes: ① veidne satur dažādus proteīnus, ② veidnē ir Taq enzīma inhibitors, ③ veidnē esošais proteīns netiek izvadīts, īpaši grupas proteīns hromosomā.⑤ Atmīnētāju nukleīnskābju deģenerācija nav rūpīga.Ja fermentu un praimeru kvalitāte ir laba, nav pastiprināšanas joslas, kas, visticamāk, ir paraugu gremošanas ārstēšana.Kaut kas nav kārtībā ar šablona nukleīnskābju ekstrakcijas procesu, tāpēc, lai sagatavotu efektīvu un stabilu gremošanas šķīdumu, tā procedūra ir jāfiksē, nevis patvaļīgi jāmaina.

Fermentu inaktivācija: jauns enzīms vai gan vecie, gan jaunie enzīmi ir jāizmanto kopā, lai analizētu, vai enzīma aktivitāte ir zaudēta vai nepietiekama, tādējādi radot viltus negatīvus rezultātus.Jāņem vērā, ka dažkārt tiek aizmirsts Taq enzīms jeb etīdija bromīds.

Primer: gruntskrāsas kvalitāte, grunts koncentrācija un vai abu gruntskrāsu koncentrācija ir simetriska.Tas ir izplatīts PCR neveiksmes iemesls vai pieaugošā josla nav ideāla un tai ir tendence izkliedēties.Ir problēmas ar dažu partiju numuru primeru kvalitāti.Abiem primeriem ir augsta koncentrācija un zema koncentrācija, kas izraisa zemas efektivitātes asimetrisku pastiprināšanu.Pretpasākumi ir šādi: ① Izvēlieties labu primer, lai sintezētu vienības.② Primera koncentrācija ir atkarīga ne tikai no OD vērtības, bet arī pievērš uzmanību grunts sākotnējam šķidrumam, lai veiktu agara cukura gēla elektroforēzi.Jābūt grunts sloksnes zonai, un abu gruntskrāsu spilgtumam kopumā jābūt vienādam.Siksna, PCR šobrīd var neizdoties, un tas ir jāatrisina ar primer sintēzes vienību.Ja gruntskrāsa ir augsta, spilgtums ir zems, un atšķaidīšanas laikā tā koncentrācijai jābūt līdzsvarotai.③ Primer ir jāmaksā un jāuzglabā augstā koncentrācijā, lai novērstu vairākkārtēju ledusskapja daļu sasalšanu vai ilgstošu atdzesēšanu, kas izraisīs grunts nolietošanos un noārdīšanos.④ Gruntskrāsas dizains ir nepamatots, piemēram, gruntskrāsas garums ir nepietiekams, un starp gruntskrāsām ir izveidojies diklāsters.

Mg2+koncentrācija: Mg2+jonu koncentrācijai ir liela ietekme uz PCR amplifikācijas efektivitāti.Pārmērīga koncentrācija var samazināt pretējā dzimuma PCR pastiprināšanu.Ja koncentrācija ir pārāk zema, PCR amplifikācijas izvade pat izraisīs PCR amplifikācijas kļūmi bez izplešanās joslas.

Reakcijas tilpuma maiņa: PCR amplifikācijā izmantotais tilpums ir 20 ul, 30 ul un 50 ul vai 100 ul, lielais PCR amplifikācijas pielietojuma apjoms tiek iestatīts atbilstoši dažādiem zinātniskās izpētes un klīniskās pārbaudes mērķiem.Pēc nelielu tilpumu, piemēram, 20ul, izgatavošanas, veicot izmēru, ir nepieciešams izveidot auklas stāvokli, pretējā gadījumā tas neizdosies.

Fiziski iemesli: transformācija ir ļoti svarīga PCR pastiprināšanai.Ja deģenerācijas temperatūra ir zema, deģenerācijas laiks ir īss, tas, visticamāk, notiks viltus negatīvos;pārāk zema atlaidināšanas temperatūra var izraisīt nespecifisku pastiprināšanu un samazināt specifiskās pastiprināšanas efektivitāti.Ļoti ietekmē praimeru un veidņu kombināciju, lai samazinātu PCR amplifikācijas efektivitāti.Dažreiz ir nepieciešams izmantot standarta termometrus, lai noteiktu mainīgumu, atlaidināšanu un pagarināto temperatūru pagarinājuma vai ūdenī šķīstošā plītī, kas ir viens no PCR neveiksmes iemesliem.

Mērķa sekvences varianti: ja notiek mērķa secība, mutācija vai dzēšana, prototipa un veidnes kombinācija ir apvienota vai mērķa sekvences trūkuma dēļ praimeris un veidne zaudēs komplementāro secību, un tā PCR amplifikācija nebūs veiksmīga.

● Kļūdaini pozitīvs

Šķiet, ka PCR pastiprināšanas josla atbilst mērķa secības joslai, un dažreiz tās josla ir precīzāka un augstāka.

Praimera dizains nav piemērots: izvēlētajai amplifikācijas secībai un bezmērķīgai amplifikācijas secībai ir homologas, tāpēc, veicot PCR pastiprināšanu, pastiprinātie PCR produkti ir nemērķtiecīgas sekvences.Mērķa secība ir pārāk īsa vai primer ir pārāk īss, un tai ir tendence uz viltus pozitīvu rezultātu.Jāpārveido.

Mērķa sekvences vai amplifikācijas produktu savstarpējs piesārņojums: šim piesārņojumam ir divi iemesli: pirmkārt, visa genoma vai lielu segmentu savstarpējs piesārņojums, kas izraisa viltus pozitīvus rezultātus.Šāda veida viltus pozitīvo rezultātu var atrisināt ar šādām metodēm: Darbības laikā esiet piesardzīgs un saudzīgs, lai novērstu mērķa secības ieelpošanu parauga pistolē vai izšļakstīšanos no centrbēdzes mēģenes.Izņemot fermentus un vielas, kas nevar izturēt augstu temperatūru, visi reaģenti vai aprīkojums jādezinficē ar augstu spiedienu.Centrbēdzes caurules un paraugi jāizmanto vienlaikus.Ja nepieciešams, pirms paraugu pievienošanas reakcijas cauruli un reaģentu pakļauj ultravioletajiem stariem, lai iznīcinātu esošo nukleīnskābi.Otrkārt, nelieli fragmenti gaisa piesārņojumā.Šie mazie fragmenti ir īsāki par mērķa secību, taču tiem ir noteikta homoloģija.To var savienot savā starpā.Pēc primeru papildināšanas PCR produktu var paplašināt, kas izraisīs viltus pozitīvu produkciju.To var izmantot, lai samazinātu vai likvidētu ligzdas PCR metodi.

● Parādās nespecifiska pastiprināšanas josla

Joslas, kas parādījās pēc PCR amplifikācijas, neatbilst paredzamajam izmēram vai lielas vai mazas, vai tajā pašā laikā, vai tajā pašā laikā, specifiskas amplifikācijas joslas un nespecifiskas amplifikācijas joslas.Nespecifisku joslu rašanās ir: Pirmkārt, primeri ir nepilnīgi komplementāri mērķa secībai vai primera polimerizācijai, veidojot diklasteri.Otrais ir tas, ka MG2+ jonu koncentrācija ir pārāk augsta, atkausēšanas temperatūra ir pārāk zema un PCR ciklu skaits ir saistīts.Otrkārt, fermentu kvalitāte un daudzums.Bieži vien dažu avotu fermenti ir pakļauti nespeciālām joslām, bet cita avota fermenti nav sastopami.Dažreiz notiek arī nespecifiska enzīmu pastiprināšanās.Pretpasākumi ir šādi: nepieciešamības gadījumā pārveidojiet pievilcības priekšmetus.Samaziniet fermenta daudzumu vai nomainiet fermentu no cita avota.Samaziniet primāro, atbilstoši palieliniet veidņu skaitu un samaziniet ciklu skaitu.Pareizi paaugstiniet atkausēšanas temperatūru vai izmantojiet divu temperatūras punktu metodi (93°C deģenerācija, atkausēšana un pagarināšana aptuveni 65°C).

● Parādās pārslains grīslis vai smērlente

Dažkārt šķiet, ka PCR pastiprināšana tiek izmantota, lobīta vai paklājam līdzīga josta.Šī iemesla dēļ pārmērīga fermentu daudzuma vai sliktās fermenta kvalitātes dēļ dNTP koncentrācija ir pārāk augsta, Mg2+ koncentrācija ir pārāk augsta, atkausēšanas temperatūra ir pārāk zema un ciklu skaits ir pārāk liels.Pretpasākumi ir šādi: ①Samaziniet fermentu daudzumu vai mainiet cita avota fermentu.② Samaziniet dNTP koncentrāciju ③ Pareizi samaziniet Mg2+ koncentrāciju.④ Palieliniet veidņu skaitu un samaziniet ciklu skaitu.

Saistītie produkti

PCR Heroᴹ (ar krāsu)

◮ Augstāka precizitāte: 6 reizes lielāka nekā parastajam Taq fermentam;

◮ Ātrāks pastiprināšanas ātrums

◮ Lielāka veidņu pielāgošanās spēja

◮ Augstāka pastiprināšanas efektivitāte

◮ Vides tolerance ir spēcīgāka: uz nedēļu novieto 37°C, saglabājot vairāk nekā 90% aktivitāti;

◮ Tam ir 5'→3' DNS polimerāzes aktivitāte un 5'→3' eksonukleāzes aktivitāte, bez 3'→5' eksonukleāzes aktivitātes.

PCR Easyᵀᴹ (ar krāsu)

Unikālā reakcijas sistēma un augstas efektivitātes Taq DNS polimerāze nodrošina PCR reakciju ar augstāku pastiprināšanas efektivitāti, specifiskumu un jutīgumu.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-SYBR Green I

◮ Vienpakāpes komplekts padara reverso transkripciju un qPCR divas reakcijas vienā mēģenē, tikai jāpievieno šablona RNS, specifiski PCR primeri un RNāzes nesaturošs ddH₂O.

◮ Komplekts var ātri un efektīvi kvantitatīvi analizēt vīrusu RNS vai izsekot RNS.

◮ Komplektā tiek izmantots unikāls Foregene reversās transkripcijas reaģents un Foregene HotStar Taq DNS polimerāze apvienojumā ar unikālu reakcijas sistēmu, lai efektīvi uzlabotu reakcijas amplifikācijas efektivitāti un specifiskumu.

◮ Optimizētā reakcijas sistēma nodrošina, ka reakcijai ir augstāka noteikšanas jutība, spēcīgāka termiskā stabilitāte un labāka tolerance.

◮ RT-qPCR Easy^TM(One Step)-SYBR Green I komplektā ir iekļauta ROX iekšējā atsauces krāsa, ko var izmantot, lai novērstu signāla fona un signāla kļūdas starp urbumiem, ko klientiem ir ērti izmantot dažādos kvantitatīvo PCR instrumentu modeļos.

RT Easy^TMII (Galvenais premikss priekš pirmās virknes cDNS sintēze priekšreālā laika PCR)

-Efektīva spēja noņemt gDNS, kas var noņemt gDNS veidnē 2 minūšu laikā.

-Efektīva reversās transkripcijas sistēma, pirmās cDNS virknes sintēzes pabeigšanai nepieciešamas tikai 15 minūtes.

-Sarežģītas veidnes: veidnes ar augstu GC saturu un sarežģītu sekundāro struktūru var arī apgriezt ar augstu efektivitāti.

-Augstas jutības reversās transkripcijas sistēma, pg līmeņa veidnes var iegūt arī augstas kvalitātes cDNS.

-Reversās transkripcijas sistēmai ir augsta termiskā stabilitāte, optimālā reakcijas temperatūra ir 42 ℃, un tai joprojām ir laba reversās transkripcijas veiktspēja 50 ℃.