PCR (polimerāzes ķēdes reakcija) ir viena no in vitro DNS amplifikācijas tehnoloģijām ar vairāk nekā 30 gadu vēsturi.

PCR tehnoloģiju 1983. gadā aizsāka Karijs Mulliss no Setusas, ASV. Mulliss iesniedza pieteikumu PCR patentam 1985. gadā un tajā pašā gadā publicēja pirmo PCR akadēmisko rakstu par zinātni.Mullisam par darbu 1993. gadā tika piešķirta Nobela prēmija ķīmijā.

PCR pamatprincipi

PCR var pastiprināt mērķa DNS fragmentus vairāk nekā vienu miljonu reižu.Principu katalizē DNS polimerāze, kā veidni izmantojot sākotnējo DNS virkni un kā pagarinājuma sākumpunktu specifisku primeru.To atkārto in vitro, izmantojot tādas darbības kā denaturācija, atkausēšana un pagarināšana.DNS meitas virknes process, kas komplementārs ar vecāku virknes veidnes DNS.

Standarta PCR process ir sadalīts trīs posmos:

1. Denaturācija: izmantojiet augstu temperatūru, lai atdalītu DNS dubultsvītras.Ūdeņraža saite starp DNS dubultvirknēm tiek pārtraukta augstā temperatūrā (93-98 ℃).

2. Atkvēlināšana: pēc divpavedienu DNS atdalīšanas pazeminiet temperatūru, lai primer varētu saistīties ar vienpavedienu DNS.

3. Pagarinājums: DNS polimerāze sāk sintezēt komplementāras virknes gar DNS virknēm no primeriem, kas saistīti, kad temperatūra tiek pazemināta.Kad pagarinājums ir pabeigts, tiek pabeigts cikls, un DNS fragmentu skaits dubultojas

Veicot šos trīs soļus 25-35 reizes, DNS fragmentu skaits pieaugs eksponenciāli.

PCR atjautība ir tāda, ka dažādiem mērķa gēniem var izveidot dažādus primerus, lai mērķa gēnu fragmentus varētu pastiprināt īsā laika periodā.

Līdz šim PCR var iedalīt trīs kategorijās, proti, parastajā PCR, fluorescējošā kvantitatīvā PCR un digitālajā PCR.

Pirmā parastā PCR paaudze

Izmantojiet parastu PCR amplifikācijas instrumentu, lai pastiprinātu mērķa gēnu, un pēc tam izmantojiet agarozes gēla elektroforēzi, lai noteiktu produktu, var veikt tikai kvalitatīvu analīzi.

Pirmās paaudzes PCR galvenie trūkumi:

1. Nosliece uz nespecifisku pastiprināšanos un viltus pozitīviem rezultātiem.

2. Atklāšana aizņem ilgu laiku, un darbība ir apgrūtinoša.

3. Var veikt tikai kvalitatīvu testu

Otrās paaudzes reāllaika PCR

Reāllaika PCR, kas pazīstams arī kā qPCR, izmanto fluorescējošās zondes, kas var norādīt reakcijas sistēmas gaitu, un uzrauga pastiprināto produktu uzkrāšanos, uzkrājoties fluorescējošiem signāliem, un novērtē rezultātus, izmantojot fluorescences līkni.To var kvantitatīvi noteikt, izmantojot Cq vērtību un standarta līkni.

Tā kā qPCR tehnoloģija tiek veikta slēgtā sistēmā, piesārņojuma iespējamība ir samazināta, un fluorescences signālu var kontrolēt kvantitatīvi, tāpēc tā ir visplašāk izmantotā klīniskajā praksē un ir kļuvusi par dominējošo tehnoloģiju PCR.

Fluorescējošās vielas, ko izmanto reāllaika fluorescējošajā kvantitatīvajā PCR, var iedalīt: TaqMan fluorescējošā zonde, molekulārās bākas un fluorescējošā krāsa.

1) TaqMan fluorescējošā zonde:

PCR amplifikācijas laikā tiek pievienota īpaša fluorescējoša zonde, vienlaikus pievienojot praimeru pāri.Zonde ir oligonukleotīds, un abi gali ir marķēti ar reportiera fluorescējošu grupu un slāpētāja fluorescējošu grupu.

Kad zonde ir neskarta, fluorescējošo signālu, ko izstaro reportieru grupa, absorbē dzēšanas grupa;PCR amplifikācijas laikā Taq enzīma 5′-3′ eksonukleāzes aktivitāte sašķeļ un degradē zondi, padarot reportiera fluorescējošu grupu un dzēsēju. Fluorescējošā grupa tiek atdalīta, lai fluorescences uzraudzības sistēma varētu uztvert fluorescences signālu, tas ir, katru reizi, kad tiek veidota DNS molekula, tiek pastiprināta fluorescence, tiek pastiprināta DNS virkne, tiek pastiprināts signāls. ir pilnībā sinhronizēts ar PCR produkta veidošanos.

2) SYBR fluorescējošā krāsviela:

PCR reakcijas sistēmā tiek pievienots SYBR fluorescējošās krāsas pārpalikums.Pēc tam, kad SYBR fluorescējošā krāsa ir nespecifiski iekļauta DNS dubultajā pavedienā, tā izstaro fluorescējošu signālu.SYBR krāsvielas molekula, kas nav iekļauta ķēdē, neizstaro fluorescējošu signālu, tādējādi nodrošinot fluorescējošu signālu. PCR produktu pieaugums ir pilnībā sinhronizēts ar PCR produktu pieaugumu.SYBR saistās tikai ar divpavedienu DNS, tāpēc kušanas līkni var izmantot, lai noteiktu, vai PCR reakcija ir specifiska.

3) Molekulārā bāka:

Tā ir cilpas cilpas divkārši marķēta oligonukleotīdu zonde, kas veido apmēram 8 bāzu matadata struktūru 5 un 3 galos.Nukleīnskābju sekvences abos galos ir komplementāri savienotas, izraisot fluorescējošās grupas un slāpējošās grupas sasprindzinājumu.Aizveriet, fluorescence netiks radīta.

Pēc PCR produkta ģenerēšanas atkausēšanas procesa laikā molekulārās bākas vidusdaļa tiek savienota pārī ar noteiktu DNS sekvenci, un fluorescējošais gēns tiek atdalīts no slāpētāja gēna, lai radītu fluorescenci.

Galvenie otrās paaudzes PCR trūkumi:

Joprojām trūkst jutīguma, un paraugu ar zemu kopiju noteikšana ir neprecīza.

Pastāv fona vērtības ietekme, un rezultāts ir jutīgs pret traucējumiem.

Ja reakcijas sistēmā ir PCR inhibitori, noteikšanas rezultāti ir jutīgi pret traucējumiem.

Trešās paaudzes digitālā PCR

Digitālā PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) aprēķina mērķa sekvences kopiju skaitu, izmantojot beigu punkta noteikšanu, un var veikt precīzu absolūto kvantitatīvo noteikšanu, neizmantojot iekšējās kontroles un standarta līknes.

Digitālajā PCR tiek izmantota beigu punkta noteikšana un tā nav atkarīga no Ct vērtības (cikla sliekšņa), tāpēc digitālo PCR reakciju mazāk ietekmē pastiprināšanas efektivitāte, un tiek uzlabota tolerance pret PCR reakcijas inhibitoriem ar augstu precizitāti un reproducējamību.

Augstas jutības un augstas precizitātes īpašību dēļ PCR reakcijas inhibitori to viegli neiejaucas, un tas var sasniegt patiesu absolūto kvantitatīvo noteikšanu bez standarta produktiem, kas ir kļuvis par pētniecības un pielietojuma karsto punktu.

Atbilstoši dažādām reakcijas vienības formām to var iedalīt trīs galvenajos veidos: mikrofluidiskās, mikroshēmas un pilienu sistēmas.

1) Mikrofluidiskais digitālais PCR, mdPCR:

Pamatojoties uz mikrofluidisko tehnoloģiju, DNS veidne tiek atdalīta.Mikrofluidiskā tehnoloģija var realizēt parauga nano-jaunināšanu vai mazāku pilienu ģenerēšanu, taču pilieniem ir nepieciešama īpaša adsorbcijas metode un pēc tam jāapvieno ar PCR reakcijas sistēmu.mdPCR pakāpeniski tika pieņemts, aizstājot citas metodes.

2) Uz pilienu balstīta digitālā PCR, ddPCR:

Izmantojiet ūdens eļļā pilienu ģenerēšanas tehnoloģiju, lai apstrādātu paraugu pilienos, un sadaliet reakcijas sistēmu, kurā ir nukleīnskābes molekulas, tūkstošiem nanomēroga pilienu, no kuriem katrs nesatur nosakāmo nukleīnskābes mērķa molekulu vai satur vienu vai vairākas pārbaudāmās nukleīnskābes mērķa molekulas.

3) Uz mikroshēmu balstīta digitālā PCR, cdPCR:

Izmantojiet integrēto šķidruma ceļa tehnoloģiju, lai iegravētu daudzas mikrocaurules un mikrodobumus uz silīcija plāksnēm vai kvarca stikla, un kontrolētu šķīduma plūsmu caur dažādiem vadības vārstiem un sadalītu parauga šķidrumu vienāda izmēra nanometros reakcijas iedobēs digitālajai PCR reakcijai, lai panāktu absolūtu kvantitatīvu noteikšanu.

Trešās paaudzes PCR galvenie trūkumi:

Iekārtas un reaģenti ir dārgi.

Veidnes kvalitātes prasības ir augstas.Ja veidnes daudzums pārsniedz mikrosistēmas daudzumu, to nebūs iespējams noteikt, un, ja tas ir pārāk mazs, kvantitatīvās noteikšanas precizitāte tiks samazināta.

Viltus pozitīvus rezultātus var ģenerēt arī tad, ja ir nespecifiska pastiprināšana.