COVID-19 ir infekcijas slimība, ko izraisa 2. tipa koronavīrusa smagais akūts respiratorais sindroms. Kad cilvēks ir inficēts, visbiežāk sastopamie simptomi ir drudzis, klepus un elpas trūkums.

Pārbaudei izmantotos paraugus var savākt ar nazofaringeālajiem uztriepēm vai orofaringeālajiem uztriepēm.

Kas ir PCR?

Standarta koronavīrusa noteikšanas metode ir polimerāzes ķēdes reakcija, PCR.Šī ir metode, ko plaši izmanto molekulārajā bioloģijā.Tas var ātri kopēt no miljoniem līdz miljardiem specifisku DNS fragmentu.

Jaunais koronavīruss satur ļoti garu vienpavedienu RNS genomu.Lai atklātu šos vīrusus ar PCR, RNS molekulas ir jāpārvērš to komplementārajās DNS sekvencēs ar reversās transkriptāzes palīdzību, un pēc tam tikko sintezēto DNS var pastiprināt ar standarta PCR procedūrām, ko parasti sauc par RT-PCR.

RT-PCR process

RNS ekstrakcija

Lai veiktu šo metodi, būtībā ir jāizņem vīrusa RNS.Ērtai, ātrai un efektīvai atdalīšanai var izmantot dažādus RNS attīrīšanas komplektus.

Lai iegūtu vīrusa RNS, izmantojot komerciālu komplektu, vispirms pievienojiet paraugu mikrocentrifūgas mēģenē un pēc tam sajauciet to ar līzes buferšķīdumu.Šis buferis ir ļoti denaturēts un parasti sastāv no fenola un guanidīna izotiocianāta.Turklāt RNāzes inhibitori parasti atrodas līzes buferšķīdumā, lai nodrošinātu neskartas vīrusa RNS izolāciju.

Pēc līzes buferšķīduma pievienošanas maisīšanas mēģeni virpuļo ar impulsu un inkubē istabas temperatūrā.Pēc tam vīruss tiek lizēts ļoti denaturējošos apstākļos, ko nodrošina līzes buferis.

Pēc parauga lizēšanas attīrīšanas procedūrai izmanto centrifūgas mēģeni.Paraugu ievieto centrifūgas mēģenē un pēc tam centrifugē.

Šī procedūra ir cietās fāzes ekstrakcijas metode, kurā stacionārā fāze sastāv no silikagēla matricas.

Optimālos sāls un pH apstākļos RNS molekulas saistās ar silīcija dioksīda membrānu.

Tajā pašā laikā tiek noņemti proteīni un citi piesārņotāji.

Pēc centrifugēšanas ievietojiet centrifūgas mēģeni tīrā savākšanas mēģenē, izmetiet filtrātu un pēc tam pievienojiet mazgāšanas buferi.

Ievietojiet mēģeni vēlreiz centrifūgā, lai izspiestu mazgāšanas buferi cauri membrānai.Tas noņems visus atlikušos piemaisījumus no membrānas, atstājot tikai RNS, kas saistās ar silikagelu.

Pēc parauga mazgāšanas ievietojiet mēģeni tīrā mikrocentrifūgas mēģenē un pievienojiet eluēšanas buferšķīdumu.

Pēc tam to centrifugē, lai eluēšanas buferi izspiestu cauri membrānai.Elucijas buferis noņem vīrusu RNS no centrifūgas kolonnas un iegūst attīrītu RNS, kas nesatur olbaltumvielas, inhibitorus un citus piesārņotājus.

2. SOLIS

Jaukts koncentrāts

Pēc vīrusa RNS ekstrakcijas nākamais solis ir sagatavot reakcijas maisījumu PCR amplifikācijai.Šajā posmā tiek izmantots koncentrāts.Šis koncentrētais šķīdums ir iepriekš sajaukts koncentrēts šķīdums, kas sastāv no premiksa, reversās transkriptāzes, nukleotīdiem, priekšējā primera, reversā primera, TaqMan zondes un DNS polimerāzes.

Visbeidzot, lai pabeigtu šo reakcijas maisījumu, pievieno RNS veidni.Caurules sajauc ar impulsa virpuļošanu, un pēc tam reakcijas maisījumu ievieto PCR plāksnē.PCR plāksnē parasti ir 96 iedobes, un tajā var vienlaikus analizēt vairākus paraugus.

3. SOLIS

PCR amplifikācija

Pēc tam ievietojiet plāksni PCR iekārtā, kas būtībā ir termiskais cikleris.

Reāllaika RT-PCR tiek izmantots, lai noteiktu 2019. gada jauno koronavīrusu, pastiprinot mērķa secību RdrRP gēnā, E gēnā un N gēnā.Mērķa gēna izvēle ir atkarīga no praimera un zondes secības.

Pirmais RT-PCR solis ir reversā transkripcija.Tiek sintezēta pirmā komplementārās DNS virkne, ko ierosina PCR reversais praimeris, kas saistās ar vīrusa RNS genoma komplementāro daļu.Pēc tam reversā transkriptāze pievieno DNS nukleotīdus praimera 3′galam, lai sintezētu DNS, kas ir komplementāra ar vīrusa RNS.Šī posma temperatūra un ilgums ir atkarīgs no izmantotajiem praimeriem, mērķa RNS un reversās transkriptāzes.

Pēc tam tiek veikts sākotnējais denaturācijas solis, kā rezultātā tiek denaturēts RNS-DNS hibrīds.Šis solis ir nepieciešams, lai aktivizētu DNS polimerāzi.Tajā pašā laikā reversā transkriptāze tiek inaktivēta.

PCR sastāv no termisko ciklu sērijas.Katrs cikls sastāv no denaturēšanas, atkausēšanas un pagarināšanas posmiem.

Denaturēšanas solis ietver reakcijas kameras karsēšanu līdz 95 grādiem pēc Celsija un tās izmantošanu divpavedienu DNS veidnes denaturēšanai.

Nākamajā solī reakcijas temperatūra tiek samazināta līdz 58 grādiem pēc Celsija, ļaujot priekšējam primeram pievienoties tās vienpavedienu DNS veidnes komplementārajai daļai.Atkausēšanas temperatūra ir tieši atkarīga no gruntskrāsas garuma un sastāva.

Pagarinājuma posmā DNS polimerāze sintezē jaunu DNS virkni, kas ir komplementāra DNS veidnes virknei.Pievienojot veidnei komplementārus brīvus kodolus 5′ līdz 3′ virzienā no reakcijas maisījuma.Šī posma temperatūra ir atkarīga no izmantotās DNS polimerāzes.

Pēc pirmā cikla tiek iegūts divpavedienu DNS mērķis.

Pēc tam ievadiet otro ciklu.Divpavedienu DNS tiek denaturēta, lai iegūtu divas vienpavedienu DNS molekulas.

Nākamajā solī reakcijas temperatūra tiek pazemināta, praimeri tiek pievienoti katrai vienas virknes DNS veidnei, un Taq-man zonde tiek pievienota mērķa DNS komplementārajai daļai.

TaqMan zonde sastāv no fluorofora, kas kovalenti saistīts ar oligonukleotīdu zondes 5' galu.Kad ciklera gaismas avots to ierosina, fluorofors izstaro fluorescenci.Turklāt zonde sastāv no slāpētāja 3′galā.Reportiera gēna tuvums slāpētājam neļauj noteikt fluorescenci.

Pagarinājuma posmā DNS polimerāze sintezē jaunu virkni.Kad polimerāze sasniedz TaqMan zondi, tās endogēnā 5′nukleāzes aktivitāte sašķeļ zondi, atdalot krāsu no dzesētāja.

Ar katru PCR ciklu izdalās vairāk krāsvielu molekulu, kā rezultātā palielinās fluorescences intensitāte proporcionāli sintezēto amplikonu skaitam.

Šī metode ļauj novērtēt paraugā esošās dotās secības skaitu.Katrā ciklā divpavedienu DNS fragmentu skaits dubultojas.Tāpēc PCR var izmantot, lai analizētu ļoti mazus paraugus.

Luminiscences signāla mērīšanai, volframa halogēna lampa, ierosmes filtrs, reflektors, objektīvs, emisijas filtrs un lādēšanai savienota ierīce - izmantojiet CCD kameru.

4. SOLIS Atklājiet

Luminiscences signāla mērīšanai, volframa halogēna lampa, ierosmes filtrs, reflektors, objektīvs, emisijas filtrs un lādēšanai savienota ierīce - izmantojiet CCD kameru.

Filtrētā gaisma no lampas tiek atspoguļota reflektorā, iziet cauri kondensatora lēcai un tiek fokusēta uz katra cauruma centru.Tad no cauruma izstarotā fluorescence tiek atspoguļota no spoguļa, iziet cauri emisijas filtram un tiek uztverta ar CCD kameru.Katrā PCR ciklā ar CCD var noteikt paša ierosināto fluorofora gaismu.

Tas pārvērš uzņemto gaismu digitālos datos.Šo metodi sauc par reāllaika PCR, un tā ļauj reāllaikā uzraudzīt PCR reakcijas gaitu.