Visi runā par qRT-PCR eksperimenta principu, primer dizainu, rezultātu interpretāciju utt., bet es domāju, ka man vajadzētu padalīties ar jums par qRT-PCR eksperimentālo darbību.Tas ir mazs, bet tas ir par rezultātiem.
Pirms qRT-PCR veikšanas mums ir jābūt skaidrai izpratnei par mūsu pašu RNS un darbības metodēm.Galu galā mūsu centieni ir vērsti uz rezultātu gūšanu, nevis vienkārši vingrināšanos.Tāpēc pirms qRT-PCR veikšanas mums ir jānosaka šādas problēmas (dažas no tām attiecas tikai uz SYBR).
1 Vai esat pārliecināts, ka jūsu RNS nav degradēta?
NanoDrop 2000 var noteikt tikai RNS koncentrāciju un tīrību, bet nevar noteikt RNS integritāti.
RNS (RNS Intesity Number) vērtība var atspoguļot RNS integritāti, ko nosaka Agilent 2100 Bioanalyzer sistēma.
att. RIN vērtību shematiskā diagramma dažādiem RNS paraugiem (eikariotiem)
Tomēr laboratorijās parasti nav Agilent 2100 Bioanalyzer.Šajā gadījumā mēs varam noteikt caur formaldehīda gēlu, bet prasība pēc kopējā RNS daudzuma ir augsta, tāpēc ātrākā metode ir izmantot parasto gēla elektroforēzi.Nepieciešams atrasties vidē, kurā nav nukleāzes, tāpēc elektroforēzes tvertni, sola pudeli, gēla kronšteinu un ķemmi nepieciešams izskalot ar DEPC ūdeni.Agaroze ir arī bez nukleāzes (ja vien tā ir tikko atvērta), un iekraušanas buferis ir jāatver tikko, cik vien iespējams, ar 1,2% gelu.
Ņemiet vērā, ka gēlam jābūt pilnībā izšķīdušam, pretējā gadījumā tas radīs neviendabīgas joslas, kā parādīts attēla 9. paraugā.Ja spriegums ir pārāk augsts vai darbojas pārāk ilgi, tas radīs siltumu un izraisīs RNS degradāciju, tāpēc spriegums un laiks ir jākontrolē saprātīgi.Turklāt gēla palaišana var arī vēl vairāk noteikt, vai paraugā ir DNS atlikumi, un novērot, vai padeves iedobē ir liels skaits saglabātu joslu.
attēls.RNS noteikšana ar gēla elektroforēzi
2 Vai esat pārliecināts par savas cDNS koncentrāciju?
Lielo brāļu pieredze laboratorijā ir tāda, ka 20 ul sistēmas cDNS, kas iegūta katrā inversijā, tiek tieši atšķaidīta 20X, savukārt pēcdoktorantūras māsas tiek atšķaidītas 10X.Es parasti esmu atkarīgs no situācijas.Tā kā katra cilvēka minētā RNS kvalitāte ir atšķirīga, arī apvērsuma līmenis ir atšķirīgs, un apvērsuma tehnoloģija var nebūt stabila.
Tāpēc katru reizi, kad saņemu apgriezto cDNS, es vispirms to atšķaidīšu apmēram 3 reizes un pēc tam izmantoju mājturības gēnu, lai veiktu RT-PCR, ciklu skaits parasti ir 25 cikli, lai noteiktu konkrēto koncentrāciju un pēc tam noteiktu galīgo atšķaidīšanas koeficientu.
3 Vai esat pārliecināts, ka jūsu gruntskrāsas ir viegli lietojamas?
Tas var pārvarēt qRT-PCR kušanas līkni, taču tas joprojām maksā naudu.Laboratorijām, kurām nav daudz naudas, kad tās iegūst daudz primeru, tās var izmantot parasto RT-PCR, lai noskaidrotu, vai tā ir viena josla, un identificētu primeru specifiku.Ja laboratorijai naudas netrūkst, pēc kušanas līknes vienreiz var noteikt visu primeru specifiku.
4 Vai esat pārliecināts, ka jūsu eksperimenta apstākļi ir piemēroti?
SYBR ir jāaizsargā no spēcīgas gaismas, tāpēc, pievienojot SYBR reaģentu, mēģiniet izslēgt augšējo apgaismojumu, un, lai to pabeigtu, ir jāizmanto tikai vājš apgaismojums.
Uzglabāt SYBR 4°C temperatūrā.Lietojot, uzmanīgi apgrieziet uz augšu un uz leju, lai labi samaisītu, lai izvairītos no putu veidošanās, un enerģiski nemaisiet.
Dažām jaunākajām māsām patīk zīmēt atzīmes uz PCR tāfeles, baidoties sajaukt paraugus, kas ir nepareizi.Tā kā jūsu marķieri, ļoti iespējams, ietekmēs fluorescējošu signālu vākšanu, es parasti iesaku junioriem izmantot eksperimentālas piezīmju grāmatiņas, lai palīdzētu saglabāt atmiņu, kā parādīts tālāk.
attēls.qRT-PCR parauga ielādes diagramma
5 Vai esat pārliecināts, ka darāt to pareizi?
Noteikti valkājiet cimdus, valkājiet cimdus, valkājiet cimdus un trīs reizes sakiet svarīgas lietas.
Lai samazinātu SYBR iedarbību uz gaismu, man personīgi patīk vispirms pievienot veidni, kā parādīts attēlā zemāk.Saskaņā ar pieredzi neliela veidnes daudzuma pievienošana, visticamāk, radīs izlases kļūdas.Tāpēc, lai pēc iespējas samazinātu kļūdu, ko rada neliela veidnes daudzuma pievienošana, es parasti vēlreiz dubultoju paraugu, un, pievienojot paraugu, dubultoju, lai samazinātu pievienotā H2O2 daudzumu.
attēls.qRT-PCR slodzes shematiska diagramma
Pēc tam konfigurējiet qRT-PCR sistēmu šādi.
attēls.qRT-PCR sistēmas sagatavošanas diagramma
PIEZĪME: Konfigurācijas process jāveic uz ledus.
Pēc parauga pievienošanas ielīmējiet caurspīdīgo blīvējuma plēvi.Centieties nepieskarties caurspīdīgās blīvplēves virsmai ar rokām, vienkārši darbojieties no vietas abās plēves pusēs.Tā kā pirkstu nospiedumi var ietekmēt arī fluorescējošu signālu savākšanu.Pēc tam izmantojiet centrifūgu, lai ātri centrifugētu 10 s ar mazu ātrumu, lai novērstu parauga karāšanos pie sienas.
Saistītie produkti:
Izlikšanas laiks: 28.04.2023
