Pārskats
Ātra transgēnu augu identificēšana
Teksts/Tong Yucheng
Eksperimentālā darbība/Han Ying
Redaktors/Vens Jujuns
Vārdi/1600+
Ieteicamais lasīšanas laiks/8-10 minūtes
Ātra transgēnu augu identificēšana
Kā jaunpienācējam laboratorijā nav labs darbs izsijāt pozitīvos augus no augu ķekara ar zemu konversijas koeficientu.Pirmkārt, DNS ir jāizņem no liela skaita paraugu pa vienam, un tad svešie gēni tiks atklāti ar PCR.Tomēr rezultāti bieži vien ir tukši un joslas ar dažiem vienumiem reizēm, bet nav iespējams noteikt, vai ir nokavēti vai nepatiesi..Vai ir ļoti bezpalīdzīgi stāties pretī šādam eksperimentālam procesam un rezultātiem?Neuztraucieties, brālis māca, kā viegli un precīzi izsijāt transgēnos pozitīvos augus.
1. darbība: Dizaina noteikšanas grunti
Nosakiet nosakāmo endogēno gēnu un eksogēno gēnu atbilstoši pārbaudāmajam paraugam un atlasiet gēnā reprezentatīvu 100–500 bp secību praimera projektēšanai.Labi primeri var nodrošināt noteikšanas rezultātu precizitāti un saīsināt noteikšanas laiku (plašāk izmantotos noteikšanas primerus skatiet pielikumā).
Piezīme:
Jaunizveidotajiem primeriem ir jāoptimizē reakcijas apstākļi un jāpārbauda noteikšanas precizitāte, precizitāte un noteikšanas robeža pirms liela mēroga noteikšanas.
2. darbība:Izstrādāt eksperimentālo protokolu
Pozitīva kontrole: izmantojiet attīrīto DNS, kas satur mērķa fragmentu, kā veidni, lai noteiktu, vai PCR reakcijas sistēma un apstākļi ir normāli.
Negatīvā/tukšā kontrole: izmantojiet DNS veidni vai ddH2O kas nesatur mērķa fragmentu kā veidni, lai noteiktu, vai PCR sistēmā ir piesārņojuma avots.
Iekšējā atsauces kontrole: izmantojiet testējamā parauga endogēnā gēna praimera/zondes kombināciju, lai novērtētu, vai veidni var noteikt ar PCR.
Piezīme:
Katram testam jāiestata pozitīvās, negatīvās/tukšās kontroles un iekšējās kontroles kontroles, lai novērtētu eksperimenta rezultātu derīgumu.
3. darbība: Eksperimenta sagatavošana
Pirms lietošanas pārbaudiet, vai šķīdums ir vienmērīgi sajaukts.Ja tiek konstatēti nokrišņi, pirms lietošanas tie ir jāizšķīdina un jāsamaisa saskaņā ar instrukcijām.2×PCR maisījums pirms lietošanas jāiepilina ar pipeti un atkārtoti jāsamaisa ar mikropipeti, lai izvairītos no nevienmērīga jonu sadalījuma.
Piezīme:
Izņemiet instrukcijas un rūpīgi izlasiet tās, un pirms eksperimenta sagatavojieties stingri saskaņā ar instrukcijām.
4. darbība. Sagatavojiet PCR reakcijas sistēmu
Saskaņā ar eksperimentālo protokolu sajauciet primerus, H2O, 2 × PCR samaisiet, centrifugējiet un sadaliet tos katrā reakcijas mēģenē.
Piezīme:
Liela mēroga vai ilgtermiņa testēšanai ieteicams izmantot UNG enzīmu saturošu PCR reakcijas sistēmu, kas var efektīvi izvairīties no PCR produktu izraisīta aerosola piesārņojuma.
5. darbība: pievienojiet reakcijas veidni
Izmantojot Direct PCR tehnoloģiju, nav nepieciešams nogurdinošs nukleīnskābju attīrīšanas process.Parauga šablonu var sagatavot 10 minūšu laikā un pievienot attiecīgajai PCR reakcijas sistēmai.
Piezīme:
Līzes metodei ir labāks noteikšanas efekts, un iegūto produktu var izmantot vairākām noteikšanas reakcijām.
5.1: lapu tiešā PCR
Atbilstoši rokasgrāmatā redzamā attēla izmēram nogrieziet lapu audus ar diametru 2-3 mm un ievietojiet to PCR reakcijas sistēmā.
Piezīme. Pārliecinieties, ka lapu fragmenti ir pilnībā iegremdēti PCR reakcijas šķīdumā, un nepievienojiet pārmērīgu lapu audu.
5.2: Lapu līzes metode
Izgrieziet lapu audus ar diametru 5-7 mm un ievietojiet to centrifūgas mēģenē.Ja izvēlaties nobriedušas lapas, lūdzu, nelietojiet lapas galvenās vēnas audus.Pipetējiet 50 ul buferšķīduma P1 lizātu centrifūgas mēģenē, lai nodrošinātu, ka lizāts var pilnībā iegremdēt lapu audus, ievietot to termiskajā ciklā vai metāla vannā un lizēt 95 °C temperatūrā 5–10 minūtes.
Pievienojiet 50 ul buferšķīduma P2 neitralizācijas šķīdumu un labi samaisiet.Iegūto lizātu var izmantot kā veidni un pievienot PCR reakcijas sistēmai.
Piezīme. Veidnes daudzumam jābūt no 5 līdz 10% no PCR sistēmas, un tas nedrīkst pārsniegt 20% (piemēram, 20 μl PCR sistēmā pievienojiet 1–2 μl līzes buferšķīduma, ne vairāk kā 4 μl).
6. darbība: PCR reakcija
Pēc PCR reakcijas mēģenes centrifugēšanas ievietojiet tos PCR instrumentā pastiprināšanai.
Piezīme:
Reakcijā amplifikācijai tiek izmantots neattīrīts šablons, tāpēc amplifikācijas ciklu skaits ir par 5-10 cikliem vairāk nekā tad, ja tiek izmantota attīrīta DNS veidne.
7. solis: elektroforēzes noteikšana un rezultātu analīze
M: 100 bp DNS kāpnes
1\4: attīrītas DNS metode
2\5: tiešā PCR metode
3\6: tukša vadīkla
Kvalitātes kontrole:
Eksperimentā iestatīto dažādo kontroles testu rezultātiem jāatbilst šādiem nosacījumiem.Pretējā gadījumā ir jāanalizē problēmas cēlonis un pēc problēmas novēršanas pārbaude jāveic vēlreiz.
1. tabula. Dažādu kontroles grupu normālie testu rezultāti
*Ja plazmīdu izmanto kā pozitīvu kontroli, endogēno gēnu testa rezultāts var būt negatīvs
Rezultāta spriedums:
A. Parauga endogēnā gēna testa rezultāts ir negatīvs, kas norāda, ka no parauga nevar iegūt parastai PCR noteikšanai piemērotu DNS vai ekstrahētā DNS satur PCR reakcijas inhibitorus, un DNS ir jāizņem vēlreiz.
B. Parauga endogēnā gēna testa rezultāts ir pozitīvs, un eksogēnā gēna testa rezultāts ir negatīvs, kas liecina, ka no parauga tiek iegūta parastajai PCR noteikšanai piemērota DNS, un var spriest, ka paraugā nav konstatēts XXX gēns.
C. Parauga endogēnā gēna testa rezultāts ir pozitīvs, bet eksogēnā gēna testa rezultāts ir pozitīvs, kas liecina, ka no parauga ir iegūta parastajai PCR noteikšanai piemērota DNS un parauga DNS satur XXX gēnu.Apstiprinājuma eksperimentus var veikt tālāk.
8. darbība: izstrādājiet noteikšanas primerus
Pēc eksperimenta izmantojiet 2% nātrija hipohlorīta šķīdumu un 70% etanola šķīdumu, lai noslaucītu eksperimentālo zonu, lai novērstu vides piesārņojumu.
Pielikums
2. tabula. Parasti izmantotie praimeri ģenētiski modificētu augu vispārējai PCR noteikšanai
Atsauces dokuments:
SN/T 1202-2010, Kvalitatīva PCR noteikšanas metode ģenētiski modificētām augu sastāvdaļām pārtikā.
Zemkopības ministrijas Paziņojums 1485-5-2010, Ģenētiski modificētu augu un to produktu sastāvdaļu pārbaude - rīsi M12 un to atvasinājumi.
Izlikšanas laiks: 2021. gada 9. jūnijs
