Ⅰ. Palieliniet reakcijas sistēmas jutību:

1. Atdaliet augstas kvalitātes RNS:

Veiksmīgu cDNS sintēzi nodrošina augstas kvalitātes RNS.Augstas kvalitātes RNS jānodrošina vismaz kopējais ilgāks un nesatur inhibitorus, kas nesatur ierakstīšanas enzīmus, piemēram, EDTA vai SDS.RNS kvalitāte nosaka sekvences informācijas maksimālo vērtību, ko varat pārrakstīt uz cDNS.Vispārējā RNS attīrīšanas metode ir izoocianāta/acidofenola izmantošanas soļu metode.Lai novērstu RNāzes piesārņojumu, RNS, kas atdalīta no parauga, kas bagāts ar RNāzi (piemēram, aizkuņģa dziedzeris), ir jāuzglabā formaldehīds, lai saglabātu augstas kvalitātes RNS, kas ir vēl jo vairāk ilgstošai uzglabāšanai.No žurku aknām ekstrahētā RNS būtībā tika noārdīta pēc vienas nedēļas uzglabāšanas ūdenī, savukārt no žurkas liesas ekstrahētā RNS saglabājās stabila pēc trīs gadu uzglabāšanas ūdenī.Turklāt transkripti, kas lielāki par 4 kb, ir jutīgāki pret RNāzes degradācijas izsekošanu nekā mazi transkripti.Lai palielinātu uzglabājamā RNS parauga stabilitāti, RNS var izšķīdināt jonu metalmīnā un uzglabāt -70 °C.Tilīds, ko izmanto, lai saglabātu RNS, nedrīkst saturēt dažādus objektus, kas degradē RNS.RNS, kas iegūta no aizkuņģa dziedzera, var tikt saglabāta metalmamīnā vismaz vienu gadu.Kad esat gatavs lietot RNS, RNS izgulsnēšanai varat izmantot šādas metodes: pievienojiet NaCl līdz 0,2 m un 4 reizes lielākam etanola tilpumam, novietojiet istabas temperatūrā uz 3–5 minūtēm un 10 000 × g centrbēdzes 5 minūtes.

2. Izmantojiet reverso transkriptāzi bez RNaseH aktivitātes (RNaseH-)

RNāzes inhibitorus bieži pievieno reversās transkripcijas reakcijām, lai palielinātu cDNS sintēzes ilgumu un iznākumu.RNāzes inhibitoru pievieno pirmajā ķēdes sintēzes reakcijā buferu un reducētāju, piemēram, DTT, klātbūtnē, jo pirms-cDNS sintēzes process denaturē inhibitoru, tādējādi atbrīvojot saistītās RNāzes, kas noārda RNS.Olbaltumvielu RNāzes inhibitors tikai novērš RNS noārdīšanos ar RNāzes A, B, C palīdzību un neaizkavē RNāzes uz ādas, tāpēc jāuzmanās, lai RNāzes neievadītu no pirkstiem, neskatoties uz šo inhibitoru lietošanu.

Reversā transkriptāze katalizē RNS pārvēršanu cDNS.Gan M-MLV, gan AMV papildus savai polimerāzes aktivitātei ir endogēna RNaseH aktivitāte.RNaseH aktivitāte konkurē ar polimerāzes aktivitāti par heterozigotām virknēm, kas veidojas starp RNS šabloniem un DNS praimeriem vai cDNS pagarinājuma virknēm, un degradē RNS: RNS virknes DNS kompleksos.RNS veidnes, ko degradē RNaseH aktivitāte, vairs nevar izmantot kā efektīvus substrātus cDNS sintēzei, samazinot cDNS sintēzes iznākumu un ilgumu.Tādējādi reversās transkriptāzes RNaseH aktivitātes likvidēšana vai ievērojami samazināšana būtu ļoti noderīga.

SuperScriptⅡ reversā transkriptāze, RNaseH MMLV reversā transkriptāze un thermoScript reversā transkriptāze, RNaseH AMV deva vairāk pilna garuma cDNS nekā MMLV un AMV.RT-PCR jutību ietekmē sintezētās cDNS daudzums.ThermoScript ir daudz jutīgāks nekā AMV.RT-PCR produktu izmēru ierobežo reversās transkriptāzes spēja sintezēt cDNS, īpaši, klonējot lielākas Cdnas.Salīdzinot ar MMLV, SuperScripⅡ ievērojami palielināja garo RT-PCR produktu ražu.RNaseH- reversā transkriptāze arī palielina termisko stabilitāti, tāpēc reakciju var veikt temperatūrā, kas ir augstāka par normālu 37-42 ℃.Ierosinātajos sintēzes apstākļos tika izmantoti oligo (dT) primeri un 10 μCi [alfa-p] dCTP.Pirmās ķēdes kopējā produkcija tika aprēķināta, izmantojot TCA nokrišņu metodi.Pilna garuma cDNS tika analizēta, izmantojot pēc izmēra šķirotas sloksnes noņemšanu un skaitīšanu sārmainā agarozes gēlā.

3. Palieliniet reversās transkripcijas siltuma saglabāšanas temperatūru:

Augstāka turēšanas temperatūra palīdz atvērt RNS sekundāro struktūru un palielināt reakcijas iznākumu.Lielākajai daļai RNS veidņu, turot RNS un praimeru 65 °C temperatūrā bez bufera vai sāls un pēc tam ātri atdzesējot uz ledus, tiek likvidēta lielākā daļa sekundāro struktūru un ļauj primeriem saistīties.Tomēr dažām veidnēm joprojām ir sekundārā struktūra pat pēc termiskās denaturācijas.Šo sarežģīto veidņu pastiprināšanu var veikt, izmantojot ThermoScript reverso transkriptāzi un novietojot reversās transkriptāzes reakciju augstākā temperatūrā, lai uzlabotu pastiprināšanu.Augstāka turēšanas temperatūra var arī palielināt specifiskumu, īpaši, ja cDNS sintēze tiek veikta, izmantojot gēnu specifiskos primerus (GSPS) (sk. 3. nodaļu).Ja izmantojat GSP, pārliecinieties, vai gruntējuma Tm vērtība ir tāda pati kā paredzamā turēšanas temperatūra.Neizmantojiet oligo(dT) un izlases primerus temperatūrā virs 60 ℃.Nejaušie primeri ir jāuztur 25 ℃ 10 minūtes, pirms to palielina līdz 60 ℃.Papildus augstākas reversās transkripcijas temperatūras izmantošanai specifiskumu var uzlabot, tieši pārnesot RNS/praimeru maisījumu no 65 ℃ denaturēšanas temperatūras uz reversās transkripcijas turēšanas temperatūru un pievienojot iepriekš uzkarsētu 2x reakcijas maisījumu (cDNS termiskās iniciācijas sintēze).Šī pieeja palīdz novērst starpmolekulāro bāzu pārī, kas notiek zemākā temperatūrā.Izmantojot PCR instrumentu, tiek vienkāršoti daudzi temperatūras slēdži, kas nepieciešami RT-PCR.

Tth termiski stabilizētā polimerāze darbojas kā DNS polimerāze Mg2+ klātbūtnē un RNS polimerāze Mn2+ klātbūtnē.Tas spēj noturēt siltumu līdz 65 ℃.Tomēr Mn2+ klātbūtne PCR laikā samazina precizitāti, kas padara Tth polimerāzi mazāk piemērotu augstas precizitātes amplifikācijai, piemēram, cDNS klonēšanai.Turklāt Tth ir mazāk efektīva reversajā transkripcijā, kas samazina jutību, un, tā kā viens enzīms var veikt reverso transkripciju un PCR, kontroles reakcijas bez reversās transkripcijas nevar izmantot, lai atšķirtu cDNS pastiprinātos produktus no piesārņotās genoma DNS produktiem.

4. Piedeva, kas veicina reverso transkripciju:

Piedevu, tostarp glicerīna un DMSO, pievienošana pirmajai ķēdes sintēzes reakcijai var samazināt nukleīnskābes divkāršās virknes stabilitāti un atritināt RNS sekundāro struktūru.Var pievienot līdz 20% glicerīna vai 10% DMSO, neietekmējot SuperScriptⅡ vai MMLV darbību.AMV var arī panest līdz 20% glicerīna, nesamazinot aktivitāti.Lai palielinātu RT-PCR jutību SuperScriptⅡ reversās transkripcijas reakcijā, var pievienot 10% glicerīna un izolēt 45 ℃ temperatūrā.Ja PCR pievieno 1/10 no retrotranskripcijas-reakcijas produkta, glicerīna koncentrācija amplifikācijas reakcijā ir 0,4%, kas nav pietiekami, lai inhibētu PCR.

5. RNaseH apstrāde:

Jutību var uzlabot, pirms PCR apstrādājot cDNS sintēzes reakcijas ar RNaseH.Dažām veidnēm tiek uzskatīts, ka RNS cDNS sintēzes reakcijā novērš pastiprināto produktu saistīšanos, un tādā gadījumā RNaseH apstrāde var palielināt jutību.Parasti RNaseH apstrāde ir nepieciešama, lai amplificētu salīdzinoši garu pilna garuma cDNS mērķa veidni, piemēram, bumbuļveida skeroziⅡ ar zemu kopiju.Šai sarežģītajai veidnei RNaseH uzlaboja signālu, ko ģenerēja cDNS, ko sintezēja SuperScriptⅡ vai AMV.Lielākajai daļai RT-PCR reakciju apstrāde ar RNaseH nav obligāta, jo 95 ℃ izolētā PCR denaturācijas solis parasti hidrolizē RNS no RNS: DNS kompleksa.

6. Uzlabotas metodes nelielu RNS daudzumu noteikšanai:

RT-PCR ir īpaši sarežģīta, ja ir pieejams tikai neliels RNS daudzums.Glikogēna kā nesēja pievienošana RNS atdalīšanas laikā palīdz palielināt mazu paraugu ražu.Vienlaikus ar Trizol var pievienot glikogēnu, kas nesatur RNāzi.Glikogēns ir ūdenī šķīstošs un var palikt ūdens fāzē ar RNS, lai palīdzētu turpmākajā nokrišņu veidošanā.Ieteicamā RNāzes nesaturošā glikogēna koncentrācija ir 250 μg/ml paraugiem, kas mazāki par 50 mg audu vai 106 kultivētām šūnām.

Acetilēta BSA pievienošana reversās transkripcijas reakcijām, izmantojot SuperScriptⅡ, var palielināt jutību, un maziem RNS daudzumiem, samazinot SuperScriptⅡ daudzumu un pievienojot 40 vienības RnaseOut nukleāzes inhibitora, var uzlabot noteikšanas līmeni.Ja RNS atdalīšanai izmanto glikogēnu, joprojām ir ieteicams pievienot BSA vai RNāzes inhibitorus reversās transkripcijas reakcijām, izmantojot SuperScriptⅡ.

Ⅱ. Palieliniet RT-PCR specifiku

1. cNDA sintēze:

Lai uzsāktu pirmās ķēdes cDNS sintēzi, var izmantot trīs dažādas metodes, un katras metodes relatīvā specifika ietekmē sintezētās cDNS daudzumu un veidu.

Izlases primer metode ir vismazāk specifiska no trim metodēm.Praimeri tiek atkausēti vairākās vietās visā transkriptā, lai iegūtu īsu, daļēja garuma cDNS.Šo metodi bieži izmanto, lai iegūtu 5′ gala sekvences un cDNS no RNS veidnēm ar sekundāriem strukturāliem reģioniem vai beigu vietām, kuras nevar replicēties reversā transkriptāze.Lai iegūtu garāko cDNS, katrā RNS paraugā empīriski jānosaka praimeru attiecība pret RNS.Izlases praimeru sākotnējā koncentrācija svārstās no 50 līdz 250 ng uz 20 μl reakcijas sistēmu.Tā kā cDNS, kas sintezēta no kopējās RNS, izmantojot nejaušus primerus, galvenokārt ir ribosomu RNS, poli(A)+RNS parasti izvēlas kā veidni.

Oligo(dT) iniciācija ir specifiskāka nekā izlases praimeri.Tas hibridizējas ar poli(A) asti, kas atrodas mRNS 3' galā lielākajā daļā eikariotu šūnu.Tā kā poli(A)+RNS ir aptuveni 1% līdz 2% no kopējās RNS, cDNS daudzums un sarežģītība ir daudz mazāka nekā tad, ja tiktu izmantoti izlases veida primeri.Tā augstās specifikas dēļ oligo(dT) parasti nav nepieciešama RNS un praimera attiecības optimizācija un poli(A)+ atlase.Ieteicams izmantot 0,5 μg oligo(dT) uz 20 μl reakcijas sistēmu.oligo(dT)12-18 ir piemērots lielākajai daļai RT-PCR.ThermoScript RT-PCR sistēma nodrošina oligo(dT)20, jo tai ir laba termiskā stabilitāte, un tā ir piemērota augstākai turēšanas temperatūrai.

Gēnu specifiskie praimeri (GSP) ir vislabākie specifiskie primeri reversās transkripcijas posmam.GSP ir antisense oligonukleozīds, kas var specifiski hibridizēties ar RNS galamērķa sekvencēm, nevis savienot visas RNS, piemēram, nejaušus primerus vai oligo(dT).Noteikumi, ko izmanto PCR primeru projektēšanai, attiecas arī uz reversās transkripcijas reakcijas GSP izstrādi.GSP var būt tāda pati secība kā amplifikācijas praimeris, kas atkvēlināts mRNS3′ galā, vai arī GSP var būt paredzēts atkvēlināšanai lejup pa straumi ar reversās amplifikācijas praimeri.Dažiem pastiprinātiem objektiem veiksmīgai RT-PCR ir nepieciešams izveidot vairāk nekā vienu antisensu praimeri, jo mērķa RNS sekundārā struktūra var novērst primera saistīšanos.Pirmajā ķēdes sintēzes reakcijas sistēmā 20 μl ieteicams izmantot 1 pmol antisense GSP.

2. Palieliniet reversās transkripcijas siltuma saglabāšanas temperatūru:

Lai pilnībā izmantotu GSP specifiku, jāizmanto reversā transkriptāze ar augstu termisko stabilitāti.Karstumizturīgu reverso transkriptāzi var izolēt augstākā temperatūrā, lai palielinātu reakcijas stingrību.Piemēram, ja GSP tiek atkvēlināts 55 ° C temperatūrā, GSP specifika netiek pilnībā izmantota, ja reversā transkripcija tiek veikta 37 ° C temperatūrā ar zemu stingrību, izmantojot AMV vai M-MLV.Tomēr SuperScripⅡ un ThermoScript var reaģēt 50 ℃ vai augstākā temperatūrā, kas novērš nespecifiskus produktus, kas ražoti zemākā temperatūrā.Lai nodrošinātu maksimālu specifiskumu, RNS/praimeru maisījumu var pārnest tieši no 65 ℃ denaturācijas temperatūras uz reversās transkripcijas turēšanas temperatūru, pievienojot iepriekš uzkarsētu 2 x reakcijas maisījumu (cDNS sintēzes termiska ierosināšana).Tas palīdz novērst bāzes savienošanos starp molekulām zemā temperatūrā.PCR instrumenta izmantošana vienkāršo daudzas temperatūras pārejas, kas nepieciešamas RT-PCR.

3. Samaziniet genoma DNS piesārņojumu:

Viena no iespējamām grūtībām ar RT-PCR ir tā, ka RNS piesārņo genoma DNS.Labāku RNS atdalīšanas metožu, piemēram, Trizol Reagent, izmantošana samazina genoma DNS piesārņojumu RNS preparātos.Lai izvairītos no produktiem, kas ražoti no genoma DNS, RNS var apstrādāt ar amplifikācijas pakāpes DnasⅠ, lai pirms reversās transkripcijas noņemtu piesārņoto DNS.Paraugus 10 minūtes turēja 65 ℃ temperatūrā 2,0 mM EDTA, lai pārtrauktu DNāzesⅠ gremošanu.EDTA veido magnija jonus helātus, lai novērstu magnija jonu atkarīgo RNS hidrolīzi, kas notiek augstā temperatūrā.

Lai atdalītu pastiprināto cDNS no genoma DNS amplifikācijas produkta, var izveidot primerus, kas atsevišķi savienojas ar atdalīto eksonu.PCR produkti, kas iegūti no cDNS, būs īsāki nekā tie, kas iegūti no piesārņotas genoma DNS.Ar katru RNS veidni tiek veikts arī kontrolēts eksperiments bez reversās transkripcijas, lai noteiktu, vai konkrētais fragments ir no genoma DNS vai cDNS.PCR produkti, kas iegūti, ja nav reversās transkripcijas, ir iegūti no genoma.

Saistīts produkts

RT-PCR Viegli^ᵀᴹEs (Viens solis)

-Vienpakāpes komplekts ļauj veikt reverso transkripciju un PCR vienā mēģenē.Tam ir jāpievieno tikai šablona RNS, specifiski PCR primeri un RNāzes nesaturošs ddH₂O.

-RNS kvantitatīvo analīzi reāllaikā var veikt ātri un precīzi.

- Komplektā tiek izmantots unikāls Foregene reversās transkripcijas reaģents un Foregene HotStar Taq DNS polimerāze apvienojumā ar unikālu reakcijas sistēmu, lai efektīvi uzlabotu reakcijas amplifikācijas efektivitāti un specifiskumu.

- Optimizētā reakcijas sistēma nodrošina, ka reakcijai ir augstāka noteikšanas jutība, spēcīgāka termiskā stabilitāte un labāka tolerance.

RT Easy II (ar GDNāzi) galvenais premikss pirmās virknes CDNS sintēzei reāllaika PCR ar GDNāzi

-Efektīva spēja noņemt gDNS, kas var noņemt gDNS veidnē 2 minūšu laikā.

-Efektīva reversās transkripcijas sistēma, pirmās cDNS virknes sintēzes pabeigšanai nepieciešamas tikai 15 minūtes.

-Sarežģītas veidnes: veidnes ar augstu GC saturu un sarežģītu sekundāro struktūru var arī apgriezt ar augstu efektivitāti.

-Augstas jutības reversās transkripcijas sistēma, pg līmeņa veidnes var iegūt arī augstas kvalitātes cDNS.

-Reversās transkripcijas sistēmai ir augsta termiskā stabilitāte, optimālā reakcijas temperatūra ir 42 ℃, un tai joprojām ir laba reversās transkripcijas veiktspēja 50 ℃.