1. Pamatzināšanas (ja vēlaties redzēt eksperimentālo daļu, lūdzu, pārnesiet tieši uz otro daļu)
Kā parastās PCR atvasinātā reakcija reālā laika PCR galvenokārt uzrauga amplifikācijas produkta daudzuma izmaiņas katrā PCR amplifikācijas reakcijas ciklā reāllaikā, mainot fluorescences signālu, un kvantitatīvi analizē sākuma veidni, izmantojot saistību starp ct vērtību un standarta līkni.
RT-PCR specifiskie dati irbāzes līnija, fluorescences slieksnisunCt vērtība.
| bāzes līnija: | 3.-15. cikla fluorescences vērtība ir bāzes līnija (bāzes līnija), ko izraisa neregulāra mērījuma kļūda. |
| Slieksnis (slieksnis): | Attiecas uz fluorescences noteikšanas robežu, kas iestatīta atbilstošā pozīcijā amplifikācijas līknes eksponenciālās augšanas reģionā, parasti 10 reizes pārsniedzot bāzes līnijas standarta novirzi. |
| CT vērtība: | Tas ir PCR ciklu skaits, kad fluorescences vērtība katrā reakcijas mēģenē sasniedz slieksni. Ct vērtība ir apgriezti proporcionāla sākotnējās veidnes daudzumam. |
Parastās marķēšanas metodes RT-PCR:
| metodi | priekšrocība | trūkums | piemērošanas joma |
| SYBR ZaļšⅠ | Plaša pielietojamība, jutīga, lēta un ērta | Prasības gruntēšanai ir augstas, pakļautas nespecifiskām joslām | Tas ir piemērots dažādu mērķa gēnu kvantitatīvai analīzei, gēnu ekspresijas pētījumiem un transgēnu rekombinanto dzīvnieku un augu pētījumiem. |
| TaqMan | Laba specifika un augsta atkārtojamība | Cena ir augsta un piemērota tikai konkrētiem mērķiem. | Patogēnu noteikšana, zāļu rezistences gēnu izpēte, zāļu efektivitātes novērtējums, ģenētisko slimību diagnostika. |
| molekulārā bāka | Augsta specifika, fluorescence, zems fons | Cena ir augsta, tā ir piemērota tikai noteiktam mērķim, dizains ir sarežģīts, un cena ir augsta. | Specifiska gēnu analīze, SNP analīze |
2. Eksperimentālie soļi
2.1. Par eksperimentālo grupēšanu- grupā jābūt vairākām urbām, un jābūt bioloģiskiem atkārtojumiem.
| ① | Tukša vadība | Izmanto, lai noteiktu šūnu augšanas statusu eksperimentos |
| ② | Negatīvās kontroles siRNS (nespecifiska siRNS secība) | Parādiet RNSi darbības specifiku.siRNS var izraisīt nespecifisku stresa reakciju 200 nM koncentrācijā. |
| ③ | Transfekcijas reaģenta kontrole | Izslēdziet transfekcijas reaģenta toksicitāti šūnām vai ietekmi uz mērķa gēna ekspresiju |
| ④ | siRNS pret mērķa gēnu | Nojaukt mērķa gēna ekspresiju |
| ⑤ (pēc izvēles) | pozitīva siRNS | Izmanto, lai novērstu eksperimentālās sistēmas un darbības problēmas |
| ⑥ (pēc izvēles) | Fluorescējošā kontroles siRNS | Šūnu transfekcijas efektivitāti var novērot ar mikroskopu |
2.2 Gruntskrāsu projektēšanas principi
| Pastiprināts fragmenta izmērs | Vēlams 100-150 bp |
| Primer garums | 18-25 bp |
| GC saturs | 30–70%, vēlams 45–55% |
| Tm vērtība | 58-60 ℃ |
| Secība | Izvairieties no nepārtrauktas T/C;A/G nepārtraukta |
| 3 beigu secība | Izvairieties no GC bagātiem vai AT bagātiem;gala bāze vēlams ir G vai C;vislabāk ir izvairīties no T |
| Papildināmība | Izvairieties no komplementārām sekvencēm, kas sastāv no vairāk nekā 3 bāzēm praimerī vai starp diviem primeriem |
| Specifiskums | Izmantojiet blastu meklēšanu, lai apstiprinātu primera specifiku |
①SiRNS ir specifiska sugai, un dažādu sugu secības būs atšķirīgas.
②SiRNS ir iepakots liofilizētā pulverī, ko var stabili uzglabāt 2-4 nedēļas istabas temperatūrā.
2.3. Instrumenti vai reaģenti, kas jāsagatavo iepriekš
| Primer (iekšējā atsauce) | Ieskaitot divus uz priekšu un atpakaļ |
| Primeri (mērķa gēns) | Ieskaitot divus uz priekšu un atpakaļ |
| Mērķa Si RNS (3 sloksnes) | Parasti uzņēmums sintezēs 3 sloksnes un pēc tam ar RT-PCR izvēlēsies vienu no trim. |
| Transfekcijas komplekts | Lipo2000 utt. |
| RNS ātrās ekstrakcijas komplekts | RNS ekstrakcijai pēc transfekcijas |
| Ātrās reversās transkripcijas komplekts | cDNS sintēzei |
| PCR pastiprināšanas komplekts | 2×Super SYBR Green qPCR Master Mix |
2.4. Attiecībā uz problēmām, kurām jāpievērš uzmanība konkrētajos eksperimenta posmos:
①siRNS transfekcijas process
1. Pārklāšanai varat izvēlēties 24 iedobju plāksni, 12 iedobju plāksni vai 6 iedobju plāksni (vidējā piedāvātā RNS koncentrācija katrā 24 iedobju plāksnes iedobē ir aptuveni 100-300 ng/uL), un optimālais šūnu transfekcijas blīvums ir līdz 60–80 %.
2. Transfekcijas soļi un īpašās prasības ir stingri saskaņā ar instrukcijām.
3. Pēc transfekcijas paraugus var savākt 24–72 stundu laikā mRNS noteikšanai (RT-PCR) vai olbaltumvielu noteikšanai 48–96 stundu laikā (WB).
② RNS ekstrakcijas process
1. Novērst piesārņojumu ar eksogēniem enzīmiem.Tas galvenokārt ietver stingru masku un cimdu nēsāšanu;izmantojot sterilizētus pipetes uzgaļus un EP caurules;eksperimentā izmantotajam ūdenim jābūt bez RNāzes.
2. Ieteicams veikt divreiz, kā ieteikts ātrās ekstrakcijas komplektā, kas patiešām uzlabos tīrību un ražu.
3. Atkritumu šķidrums nedrīkst pieskarties RNS kolonnai.
③ RNS kvantitatīva noteikšana
Pēc RNS ekstrakcijas to var kvantitatīvi noteikt tieši ar Nanodrop, un minimālais rādījums var būt pat 10 ng/ul.
④ Reversās transkripcijas process
1. RT-qPCR augstās jutības dēļ katram paraugam ir jāizveido vismaz 3 paralēlas iedobes, lai novērstu to, ka nākamais Ct ir pārāk atšķirīgs vai SD nav pārāk liels statistiskai analīzei.
2. Nesasaldēt un neatkausēt Master mix atkārtoti.
3. Katra caurule/caurums jāaizstāj ar jaunu uzgali!Paraugu pievienošanai neizmantojiet vienu un to pašu pipetes galu!
4. Plēve, kas pievienota 96 bedrīšu plāksnei pēc parauga pievienošanas, ir jānogludina ar plāksni.Pirms uzlikšanas uz iekārtas vislabāk ir centrifugēt, lai šķidrums uz caurules sienas varētu plūst uz leju un noņemt gaisa burbuļus.
⑤Kopējā līkņu analīze
| Nav logaritmiskās izaugsmes perioda | Iespējams, liela veidnes koncentrācija |
| Nav CT vērtības | Nepareizas darbības fluorescējošu signālu noteikšanai; praimeru vai zondu degradācija – tās integritāti var noteikt ar PAGE elektroforēzi; nepietiekams veidnes daudzums; šablonu degradācija – izvairīšanās no piemaisījumu ievadīšanas un atkārtotas sasaldēšanas un atkausēšanas paraugu sagatavošanā; |
| Ct>38 | Zema pastiprināšanas efektivitāte;PCR produkts ir pārāk garš;tiek noārdītas dažādas reakcijas sastāvdaļas |
| Lineārā pastiprinājuma līkne | Atkārtoti sasaldēšanas-atkausēšanas cikli vai ilgstoša gaismas iedarbība var daļēji sabojāt zondes |
| Dublētu caurumu atšķirība ir īpaši liela | Reakcijas šķīdums nav pilnībā izkusis vai reakcijas šķīdums nav sajaukts;PCR instrumenta termiskā vanna ir piesārņota ar fluorescējošām vielām |
2.5. Par datu analīzi
qPCR datu analīzi var iedalīt relatīvajā kvantitatīvā noteikšanā un absolūtajā kvantitatīvā noteikšanā.Piemēram, šūnas apstrādes grupā, salīdzinot ar šūnām kontroles grupā,
Cik reižu X gēna mRNS mainās, tā ir relatīvā kvantitatīva noteikšana;noteiktā skaitā šūnu X gēna mRNS
Tas, cik eksemplāru ir, ir absolūts skaitlis.Parasti laboratorijā visbiežāk izmantojam relatīvo kvantitatīvo metodi.Parasti,2-ΔΔct metodeVisvairāk tiek izmantots eksperimentos, tāpēc šeit tiks detalizēti aprakstīta tikai šī metode.
2-ΔΔct metode: iegūtais rezultāts ir mērķa gēna ekspresijas atšķirība eksperimentālajā grupā attiecībā pret mērķa gēnu kontroles grupā.Ir nepieciešams, lai gan mērķa gēna, gan iekšējā atsauces gēna amplifikācijas efektivitāte būtu tuvu 100%, un relatīvā novirze nedrīkst pārsniegt 5%.
Aprēķina metode ir šāda:
Δct kontroles grupa = mērķa gēna ct vērtība kontroles grupā – iekšējā atsauces gēna ct vērtība kontroles grupā
Δct eksperimentālā grupa = mērķa gēna ct vērtība eksperimentālajā grupā – iekšējā atsauces gēna ct vērtība eksperimentālajā grupā
ΔΔct=Δct eksperimentālā grupa-Δct kontroles grupa
Visbeidzot, aprēķiniet izteiksmes līmeņa atšķirības daudzkārtni:
Mainīt Fold=2-ΔΔct (atbilst Excel funkcijai POWER)
Saistītie produkti:
Publicēšanas laiks: 20.-20.2023
