• PCR ir metode, ko izmanto DNS pastiprināšanai no neliela DNS veidnes daudzuma.RT-PCR izmanto reverso transkripciju, lai no RNS avota iegūtu DNS veidni, ko pēc tam var pastiprināt.
• PCR un RT-PCR parasti ir beigu reakcijas, savukārt qPCR un RT-qPCR izmanto produkta sintēzes ātruma kinētiku PCR reakcijas laikā, lai kvantitatīvi noteiktu esošās veidnes daudzumu.
• Jaunākas metodes, piemēram, digitālā PCR, nodrošina sākotnējās DNS veidnes absolūto kvantitatīvo noteikšanu, savukārt tādas metodes kā izotermiskā PCR samazina nepieciešamību pēc dārgām iekārtām, lai nodrošinātu ticamus rezultātus.

Polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) ir salīdzinoši vienkārša un plaši izmantota molekulārās bioloģijas metode DNS un RNS sekvenču pastiprināšanai un noteikšanai.Salīdzinājumā ar tradicionālajām DNS klonēšanas un amplifikācijas metodēm, kas bieži vien var ilgt vairākas dienas, PCR prasa tikai dažas stundas.PCR ir ļoti jutīgs un prasa minimālu veidni specifisku secību noteikšanai un pastiprināšanai.Pamata PCR metodes ir vēl vairāk attīstījušās no vienkāršas DNS un RNS noteikšanas.Tālāk ir sniegts pārskats par dažādām PCR metodēm un reaģentiem, ko piedāvājam Enzo Life Sciences jūsu pētniecības vajadzībām.Mūsu mērķis ir palīdzēt zinātniekiem ātri piekļūt PCR reaģentiem, ko izmantot savā nākamajā pētniecības projektā!

PCR

Standarta PCR veikšanai viss, kas jums nepieciešams, ir DNS polimerāze, magnijs, nukleotīdi, primeri, pastiprināmā DNS veidne un termocikleris.PCR mehānisms ir tikpat vienkāršs kā tā mērķis: 1) divpavedienu DNS (dsDNS) tiek termiski denaturēta, 2) praimeri sakrīt ar atsevišķām DNS virknēm un 3) praimeri tiek pagarināti ar DNS polimerāzi, kā rezultātā tiek iegūtas divas DNS kopijas. sākotnējā DNS virkne.Denaturācijas, atkvēlināšanas un pagarināšanas process vairākās temperatūrās un laikos ir zināms kā viens pastiprināšanas cikls (1. att.).

Katrs cikla posms ir jāoptimizē izmantotajai veidnei un grunts komplektam.Šo ciklu atkārto aptuveni 20–40 reizes, un pēc tam pastiprināto produktu var analizēt, parasti ar agarozes želeju (2. attēls).

Tā kā PCR ir ļoti jutīga metode un atsevišķām reakcijām ir nepieciešami ļoti mazi tilpumi, vairākām reakcijām ieteicams sagatavot galveno maisījumu.Galvenais maisījums ir labi jāsamaisa un pēc tam jāsadala pēc reakciju skaita, nodrošinot, ka katrā reakcijā būs vienāds daudzums enzīmu, dNTP un primeru.Daudzi piegādātāji, piemēram, Enzo Life Sciences, piedāvā arī PCR maisījumus, kas jau satur visu, izņemot primerus un DNS veidni.

Guanīna/citozīna bagāti (ar GC) reģioni ir izaicinājums standarta PCR metodēm.Ar GC bagātās sekvences ir stabilākas nekā sekvences ar zemāku GC saturu.Turklāt ar GC bagātām sekvencēm ir tendence veidot sekundāras struktūras, piemēram, matadata cilpas.Tā rezultātā denaturācijas fāzē ir grūti pilnībā atdalīt ar GC bagātās dubultšķiedras.Līdz ar to DNS polimerāze nevar netraucēti sintezēt jauno virkni.Augstāka denaturācijas temperatūra var to uzlabot, un pielāgošana augstākai atkausēšanas temperatūrai un īsākam atkausēšanas laikam var novērst GC bagātu primeru nespecifisku saistīšanos.Papildu reaģenti var uzlabot ar GC bagāto secību pastiprināšanu.DMSO, glicerīns un betaīns palīdz izjaukt sekundārās struktūras, ko izraisa GC mijiedarbība, un tādējādi atvieglo dubulto pavedienu atdalīšanu.

Hot Start PCR

Nespecifiska amplifikācija ir problēma, kas var rasties PCR laikā.Lielākā daļa DNS polimerāžu, ko izmanto PCR, vislabāk darbojas temperatūrā no 68 °C līdz 72 °C.Tomēr ferments var būt aktīvs arī zemākā temperatūrā, lai gan zemākā mērā.Temperatūrā, kas ir daudz zemāka par atkausēšanas temperatūru, primeri var nespecifiski saistīties un izraisīt nespecifisku pastiprināšanos, pat ja reakcija notiek uz ledus.To var novērst, izmantojot polimerāzes inhibitorus, kas disociējas no DNS polimerāzes tikai tad, kad ir sasniegta noteikta temperatūra, tādēļ termins karstās palaišanas PCR.Inhibitors var būt antiviela, kas saistās ar polimerāzi un denaturējas sākotnējā denaturācijas temperatūrā (parasti 95°C).

Augstas precizitātes polimerāze

Lai gan DNS polimerāzes amplificē diezgan precīzi līdz sākotnējai veidnes secībai, var rasties kļūdas nukleotīdu saskaņošanā.Neatbilstība lietojumprogrammās, piemēram, klonēšana, var izraisīt saīsinātus transkriptus un nepareizi tulkotus vai neaktīvus proteīnus lejup pa straumi.Lai izvairītos no šīm neatbilstībām, ir identificētas un darbplūsmā iekļautas polimerāzes ar “korektūru”.Pirmā korektūras polimerāze Pfu tika identificēta 1991. gadā Pyrococcus furiosus.Šim Pfu fermentam ir 3' līdz 5' eksonukleāzes aktivitāte.Kad DNS tiek pastiprināta, eksonukleāze noņem nesakritušos nukleotīdus virknes 3' galā.Pēc tam tiek aizstāts pareizais nukleotīds, un DNS sintēze turpinās.Nepareizu nukleotīdu secību identificēšana balstās uz saistīšanās afinitāti pret pareizo nukleozīdu trifosfātu ar enzīmu, kur neefektīva saistīšanās palēnina sintēzi un ļauj veikt pareizu aizstāšanu.Pfu polimerāzes korektūras darbība rada mazāk kļūdu galīgajā secībā, salīdzinot ar Taq DNS polimerāzi.Pēdējos gados ir identificēti citi korektūras enzīmi, un ir veiktas sākotnējā Pfu enzīma modifikācijas, lai vēl vairāk samazinātu kļūdu biežumu DNS amplifikācijas laikā.

RT-PCR

Reversās transkripcijas PCR jeb RT-PCR ļauj izmantot RNS kā veidni.Papildu darbība ļauj noteikt un pastiprināt RNS.RNS tiek reversi transkribēta komplementārā DNS (cDNS), izmantojot reverso transkriptāzi.RNS veidnes kvalitāte un tīrība ir būtiska RT-PCR panākumiem.Pirmais RT-PCR solis ir DNS/RNS hibrīda sintēze.Reversajai transkriptāzei ir arī RNāzes H funkcija, kas degradē hibrīda RNS daļu.Pēc tam vienpavedienu DNS molekulu papildina no DNS atkarīgā DNS polimerāzes aktivitāte, ko veic reversās transkriptāzes kDNS.Pirmās virknes reakcijas efektivitāte var ietekmēt pastiprināšanas procesu.Turpmāk cDNS pastiprināšanai tiek izmantota standarta PCR procedūra.Iespējai RNS pārveidot par cDNS, izmantojot RT-PCR, ir daudz priekšrocību, un to galvenokārt izmanto gēnu ekspresijas analīzei.RNS ir vienpavedienu un ļoti nestabila, kas apgrūtina darbu ar to.Tas parasti kalpo kā pirmais solis qPCR, kas kvantitatīvi nosaka RNS transkriptus bioloģiskajā paraugā.

qPCR un RT-qPCR

Kvantitatīvo PCR (qPCR) izmanto, lai noteiktu, raksturotu un kvantitatīvi noteiktu nukleīnskābju daudzos lietojumos.RT-qPCR RNS transkriptus bieži kvantitatīvi nosaka, vispirms tos reversi transkribējot cDNS, kā aprakstīts iepriekš, un pēc tam tiek veikta qPCR.Tāpat kā standarta PCR, DNS tiek pastiprināta ar trīs atkārtotām darbībām: denaturāciju, atkausēšanu un pagarināšanu.Tomēr qPCR fluorescējošā marķēšana ļauj vākt datus PCR progresēšanas laikā.Šim paņēmienam ir daudz priekšrocību pieejamo metožu un ķīmisko vielu klāsta dēļ.

Uz krāsvielu balstītā qPCR (parasti zaļā krāsā) fluorescējošā marķēšana ļauj kvantitatīvi noteikt amplificētās DNS molekulas, izmantojot dsDNS saistošu krāsu.Katra cikla laikā tiek mērīta fluorescence.Fluorescences signāls palielinās proporcionāli replicētās DNS daudzumam.Tādējādi DNS kvantitatīvi tiek noteikts “reāllaikā” (3. attēls).Uz krāsvielu balstītas qPCR trūkumi ir tādi, ka vienlaikus var pārbaudīt tikai vienu mērķi un ka krāsviela saistīsies ar jebkuru paraugā esošo ds-DNS.

Uz zondēm balstītā qPCR katrā paraugā vienlaikus var noteikt daudzus mērķus, taču tas prasa optimizēt un izstrādāt mērķa specifisko zondi, ko izmanto papildus primeriem.Ir pieejami vairāki zondes konstrukciju veidi, taču visizplatītākais veids ir hidrolīzes zonde, kurā ir iekļauts fluorofors un slāpētājs.Fluorescences rezonanses enerģijas pārnešana (FRET) novērš fluorofora emisiju caur slāpētāju, kamēr zonde ir neskarta.Tomēr PCR reakcijas laikā zonde tiek hidrolizēta praimera pagarināšanas un specifiskās secības, ar kuru tā ir saistīta, amplifikācijas laikā.Zondes šķelšanās atdala fluoroforu no slāpētāja un izraisa no pastiprināšanas atkarīgu fluorescences pieaugumu (4. att.).Tādējādi fluorescences signāls no uz zondi balstītas qPCR reakcijas ir proporcionāls paraugā esošās zondes mērķa sekvences daudzumam.Tā kā uz zondi balstīta qPCR ir specifiskāka nekā uz krāsvielām balstīta qPCR, to bieži izmanto uz qPCR balstītajos diagnostikas testos.

Izotermiskā pastiprināšana

Iepriekš minētajām PCR metodēm ir nepieciešams dārgs termociklēšanas aprīkojums, lai precīzi paaugstinātu un pazeminātu kameras temperatūru denaturēšanas, atkausēšanas un pagarināšanas posmos.Ir izstrādātas vairākas metodes, kurām nav vajadzīgas tik precīzas ierīces, un tās var veikt vienkāršā ūdens vannā vai pat interesējošo šūnu ietvaros.Šīs metodes kopā sauc par izotermisko pastiprināšanu, un tās darbojas, pamatojoties uz eksponenciālo, lineāro vai kaskādes pastiprināšanu.

Vispazīstamākais izotermiskās pastiprināšanas veids ir cilpas mediētā izotermiskā pastiprināšana jeb LAMP.LAMP izmanto eksponenciālu pastiprināšanu pie 65 ⁰C, lai pastiprinātu veidnes DNS vai RNS.Veicot LAMP, jaunas DNS sintezēšanai kopā ar DNS polimerāzi tiek izmantoti četri līdz seši primeri, kas papildina mērķa DNS reģionus.Diviem no šiem primeriem ir komplementāras sekvences, kas atpazīst sekvences citos primeros un saista tos, ļaujot jaunsintezētajā DNS veidoties “cilpas” struktūrai, kas pēc tam palīdz primeru savienošanai turpmākajās amplifikācijas kārtās.LAMP var vizualizēt ar vairākām metodēm, tostarp fluorescenci, agarozes gēla elektroforēzi vai kolorimetriju.Produkta klātbūtnes vai neesamības vizualizēšanas un noteikšanas vienkāršība ar kolorimetrijas metodi un dārgo nepieciešamo iekārtu trūkums padarīja LAMP par piemērotu iespēju SARS-CoV-2 testēšanai vietās, kur nebija viegli pieejama klīniskā laboratorijas pārbaude, vai paraugu uzglabāšanai un transportēšanai. nebija iespējams, vai laboratorijās, kurās iepriekš nebija PCR termociklēšanas aprīkojuma.