RNāze ir jutīgs vārds, ko daudzi studenti, kuri bieži veic RNS ekstrakcijas eksperimentus, nevēlas dzirdēt.Pilnībā bruņota, RNS, kas beidzot tika ekstrahēta ar ļoti toksiskiem fenola un hloroforma reaģentiem, tika noārdīta.Es neesmu samierinājusies!!!Šodien apskatīsim slavenās Rnases izcelsmi.

Ribonukleāze (RNase) vai RNāze ir nukleāze, kas var hidrolizēt RNS mazās molekulās.RNāze kā mazas molekulas proteīns ir neparasti stabila .Parastā augstas temperatūras un augstspiediena tvaika sterilizācija un proteīnu inhibitori nevar to pilnībā inaktivēt.RNāzes stabilitāti galvenokārt nodrošina disulfīda saites struktūrā.Piemēram, liellopu aizkuņģa dziedzera RNāzei, ko parasti izmanto, ir tikai 124 aminoskābes, bet tajā ir 4 disulfīda saites.Sēra saite un disulfīda saite nodrošina RNāzi ar lielisku termisko stabilitāti.Turklāt rnāzei ir salīdzinoši maza molekulmasa, un tā daudzos gadījumos var ātri atjaunot sākotnējo uzbūvi.

Papildus tam, ka tas ir ļoti stabils,RNāzes laboratorijā ir visuresošas .RNāze ir bioloģisks aizsardzības mehānisms.Šūnai eksogēnā RNS bieži ir letāla.Salīdzinot ar eksogēnu DNS, eksogēnā RNS bieži ir bīstamāka.RNS tiek laimīgi transkribēta un tulkota, tāpēc gandrīz visi organismi ir attīstījuši RNāzes, lai aizsargātos pret eksogēnas RNS invāziju.Tāpēc laboratorijā kultivētās baktēriju šūnas un jūs, kas ekstrahējat RNS, izdala RNāzes aromātu.Cilvēka ķermeņa šķidrumi (siekalas, asaras utt.) satur lielu daudzumu RNāzes, tāpēc neraudiet, kad RNS ir noārdījies.Jo vairāk tu raudi, jo sliktāka ir RNS degradācija!!Māsa Daiyu nav piemērota RNS ekstrakcijai!

Turklāt jūsu maigā āda satur arī daudz RNāzes, un marķieri, pipetes, ledusskapja durvis un durvju rokturi, kuriem ir pieskārusies āda, satur arī RNāzi.

Tā kā ir tik daudz ārprātu, apskatīsim, kā rīkoties ar RNāzēm.

Pirmā lieta, par ko visi domā, noņemot RNS, irDEPC(dietilpirokarbonāts).DEPC galvenokārt denaturē proteīnu, savienojoties ar RNāzes aktīvās grupas histidīna imidazola gredzenu, tādējādi kavējot enzīma aktivitāti.0,1% DEPC var labāk noņemt Rnase, taču mums ir jāpievērš uzmanība tam, ka DEPC ir zināms kancerogēns, tāpēc, to lietojot, jāpievērš īpaša uzmanība.

Attiecībā uz RNase mums jāsāk no diviem aspektiem,pirmais ir inhibēt endogēnās RNāzes aktivitāti

Tradicionālie RNS ekstrakcijas reaģenti, piemēram, guanidīna izotiocianāts un DTT, kas atrodas Trizol, var atvērt RNāzes disulfīda saiti, taču joprojām ir dažas RNāzes, īpaši audu paraugos, tāpēc pievērsiet uzmanību zemai temperatūrai.

1.Pēc izņemšanas nekavējoties iegremdējiet audu paraugu šķidrā slāpeklī vai komerciālā RNS konservēšanas šķīdumā.

2.Pēc šūnas parauga RNS ekstrahēšanas pievienojiet to līzes šķīdumam un lizējiet uz ledus kastes

3. Slīpēšanai vislabāk izmantot šķidro slāpekli kad audu paraugi ir homogenizēti.Izmantojot elektrisko homogenizatoru bez šķidrā slāpekļa, pievērsiet uzmanību homogenāta adaptera pilnīgai iepriekšējai atdzesēšanai.

Otrais ir eksogēnā DNāze

1.Esiet pilnībā bruņoti, valkājiet laboratorijas mēteli, valkājiet masku un noteikti uzvelciet pāris jaunus cimdus (neesiet tik taupīgs!! Jāpiebilst, ka Trizol ir ļoti kodīgs, turklāt tas ir ļoti izturīgs arī caur cimdiem, tāpēc nepiliet uz rokām).

2.Visiem izmantotajiem pipetes uzgaļiem, EP caurulēm, PCR caurulēm un citam aprīkojumam jābūt apstrādātam ar RNāzi.To var mērcēt 0,1% DEPC un pēc tam paaugstināt zem spiediena.Pievērsiet uzmanību darbībai velkmes pārsegā.Vietējie tirāni var tieši iegādāties palīgmateriālus fermentu noņemšanai.

PS: Ļaujiet man pastāstīt jums slinku metodi.Lai gan augsta temperatūra un augsts spiediens nevar pilnībā noņemt RNāzi, tas noņems lielu tās daļu.2 reizes augsta temperatūra un augsts spiediens dod labu efektu, un RNS ekstrakcijai ir maza ietekme.

3.Alkohols var denaturēt olbaltumvielas,tāpēc RNS ekstrakcijas tabulu var noslaucīt ar 75% spirtu , un cimdus var arī apsmidzināt ar spirtu.

4.Galīgais RNS šķīdināšanas šķīdums un centrifūgas caurule arī jāapstrādā ar RNāzi.DEPC ūdens ir plaši izmantots RNS šķīdināšanas šķīdums.Parunāsim par pareizo DEPC ūdens sagatavošanas metodi (neaizmirstiet pārsaiņot komerciālo DEPC, kad to iegādājaties)

Pievienojiet DEPC īpaši tīram ūdenim attiecībā 1:1000, kārtīgi sakratiet, ļaujiet nostāvēties nakti 37°C un sterilizējiet 121°C augstā temperatūrā un augstā spiedienā 15 minūtes.DEPC ūdeni var uzglabāt -20°C 1 ml alikvotās daļās.

Visbeidzot, rezumējot: zema temperatūra ir galvenais, palīgmateriāli tiek apstrādāti labi, pilnībā bruņoti un mazāk runāt!

Tas ir šodienas stratēģijai.Es novēlu jums visu jūsu minēto RNS koncentrāciju un tīrību.Abi A260/A280 ir 2.0!!!

Protams, ja lietojat aRNS ekstrakcijas komplekts istabas temperatūrā, jūs, iespējams, nesaskarsities ar iepriekš minētajām problēmām.

Darbojoties istabas temperatūrā, nepievienojot DNāzi, kopējo RNS no šūnām ekstrahē 11 minūtēs un kopējo RNS no dzīvnieku audiem vai augiem ekstrahē 30 minūtēs.

Lai iegūtu izmēģinājuma paraugus, lūdzu, sazinieties ar:overseas@foregene.com

Saistītie produkti:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/