qPCR eksperimentos ļoti svarīga saite ir arī primer dizains.Tas, vai primeri ir piemēroti vai nē, ir cieši saistīts ar to, vai pastiprināšanas efektivitāte sasniedz standartu, vai pastiprinātie produkti ir specifiski un vai ir pieejami eksperimentālie rezultāti.
Tātad, kā uzlabot qPCR primer specifiku?Augsta pastiprināšanas efektivitāte?
Šodien mēs aicināsim jūs kopā izstrādāt qPCR primerus un ļausim qPCR primer dizainam kļūt par efektīvu mācības prasmi eksperimentos.
Veidojot qPCR primerus, parasti pievērsiet uzmanību šādiem punktiem: primeriem jābūt veidotiem pāri introniem, cik vien iespējams, produkta garumam jābūt 100-300 bp, Tm vērtībai jābūt pēc iespējas tuvākai 60 ° C, un augšpus un lejpus primeriem jābūt pēc iespējas tuvākiem, un praimera beigām ir jābūt G vai C utt.
1. Intronus aptverošu praimeru dizains
Izstrādājot qPCR primerus, izvēloties primerus, kas paredzēti intronos, var novērst gDNS veidnes pastiprināšanos, un visi produkti ir iegūti no cDNS amplifikācijas, tādējādi novēršot gDNS piesārņojuma ietekmi.
2. Primer garums
Praimera garums parasti ir no 18 līdz 30 nt, un amplifikācijas produkta garums ir jākontrolē no 100 līdz 300 bp, cik vien iespējams.
Ja gruntējums ir pārāk īss, tas novedīs pie nespecifiskas pastiprināšanas, un, ja tas ir pārāk garš, tas viegli veidos sekundāro struktūru (piemēram, matadata struktūru).Ja amplifikācijas produkts ir pārāk garš, tas nav piemērots polimerāzes reakcijai, kas ietekmēs PCR amplifikācijas efektivitāti.
3. GC saturs un Tm vērtība
GC saturs gruntskrāsās jākontrolē no 40% līdz 60%.Ja tas ir pārāk augsts vai pārāk zems, tas neveicina reakcijas sākšanos.Lai iegūtu tādu pašu Tm vērtību un atkvēlināšanas temperatūru, tiešā un reversā gruntējuma GC saturam jābūt tuvu vienādam.
Tm vērtībai jābūt robežās no 55 līdz 65°C, cik vien iespējams, parasti ap 60°C, un Tm vērtībai augštecē un lejtecē jābūt pēc iespējas tuvākai, vēlams ne vairāk kā 4°C.
4. Neizvēlieties A gruntskrāsas 3′ galā
Ja grunts 3′ gals nav saskaņots, pastāv lielas atšķirības dažādu bāzu sintēzes efektivitātē.Ja pēdējā bāze ir A, tā var arī uzsākt ķēdes sintēzi pat neatbilstības gadījumā, un, ja pēdējā bāze ir T Kad , neatbilstības indukcijas efektivitāte ir ievērojami samazināta.Tāpēc mēģiniet izvairīties no A izvēles gruntskrāsas 3′ galā, un labāk izvēlēties T.
Ja tas ir zondes primer, zondes 5′ gals nevar būt G, jo pat tad, ja viena G bāze ir pievienota FAM fluorescējošajai reportieru grupai, G var arī dzēst FAM grupas emitēto fluorescējošu signālu, kā rezultātā tiek iegūti kļūdaini negatīvi rezultāti.Parādās.
5. Bāzes sadalījums
Četru bāzu sadalījums primerā ir vēlams nejaušs, izvairoties no vairāk nekā 3 secīgām G vai C 3′ galā un vairāk nekā 3 secīgāmG vai C ir viegli ģenerēt savienošanu pārī GC bagātajā secību reģionā.
6. Gruntēšanas apgabalā jāizvairās no sarežģītām sekundārajām struktūrām.
Sekundārā struktūra, ko veido amplifikācijas produkta viena virkne, ietekmēs vienmērīgu PCR gaitu.Iepriekš paredzot, vai mērķa secībā ir sekundāra struktūra, mēģiniet izvairīties no šī reģiona, veidojot primerus.
7. Pašiem gruntskrāsām un starp primeriem jācenšas izvairīties no secīgām komplementārām bāzēm.
Starp pašu grunti un grunti nevar būt secīgas 4 bāzu komplementaritātes.Pašam gruntējumam nedrīkst būt papildinoša secība, pretējā gadījumā tas salocīsies, veidojot matadata struktūru, kas ietekmēs grunts un veidnes atkausēšanas kombināciju.
Papildu sekvences nevar pastāvēt starp augšpus un pakārtotajiem primeriem.Praimeru komplementaritāte radīs praimeru dimērus, kas samazinās PCR efektivitāti un pat ietekmēs kvantitatīvo precizitāti.Ja grunts-dimēra un matadata struktūras ir neizbēgamas, △G vērtība nedrīkst būt pārāk augsta (jābūt mazākai par 4,5 kcal/mol).
8. Praimeri pastiprina mērķa specifisko produktu.
QPCR noteikšanas galvenais mērķis ir izprast mērķa gēna pārpilnību.Ja notiek nespecifiska pastiprināšana, kvantitatīvā noteikšana būs neprecīza.Tāpēc pēc primeru projektēšanas tie ir jāpārbauda ar BLAST, un produktu specifika tiek salīdzināta secību datu bāzē.
Tālāk mēs ņemam cilvēka GAS6 (augšanas apturēšanas specifiskā 6) gēnu kā piemēru, lai izstrādātu qPCR primerus.
01 vaicājuma gēns
Homo GAS6caur NCBI.Šeit mums vajadzētu pievērst uzmanību gēnu nosaukuma un sugu salīdzināšanai, lai nodrošinātu to konsekvenci.
02 Atrodiet gēnu secību
(1) Ja mērķa secība ir genoma DNS, atlasiet pirmo, kas ir gēna genoma DNS secība.
(2) Ja mērķa secība ir mRNS, atlasiet otro.Pēc ievadīšanas zemāk esošajā tabulā noklikšķiniet uz “CDS”.Brūnā fona secība ir gēna kodējošā secība.
03 Dizaina gruntskrāsas
Ievadiet Primer-BLAST saskarni
Augšējā kreisajā stūrī ievadiet gēna kārtas numuru vai secību Fasta formātā un aizpildiet atbilstošos parametrus.

Noklikšķiniet uz “Iegūt primerus”, un tiks parādīts NCBI, lai paziņotu, ka šāda parametru atlase tiks paplašināta ar citiem savienošanas variantiem.Mēs varam pārbaudīt dažādus savienojuma variantus un iesniegt tos, lai iegūtu atbilstošo gruntēšanas pāri (kā parādīts attēlā zemāk).Šis process var ilgt desmitiem sekunžu.
Šo gruntskrāsu pāru atkausēšanas temperatūra ir aptuveni 60 ° C.Atbilstoši eksperimenta mērķim eksperimentam izvēlieties gruntskrāsas ar mērenu garumu, labu specifiskumu un mazāku primeru paškomplementāciju, un izdošanās rādītājs ir diezgan augsts!
04Primer specifikācijas pārbaude
Faktiski papildus gruntskrāsu projektēšanai Primer-Blast var novērtēt arī mūsu pašu izstrādātos gruntskrāsas.Atgriezieties gruntskrāsu dizaina lapā, ievadiet mūsu izstrādātos augšējo un lejpus gruntskrāsu, un citi parametri netiks pielāgoti.Pēc iesniegšanas jūs varat redzēt, vai primeru pāris pastāv arī citos gēnos.Ja tie visi ir parādīti gēnā, kuru mēs vēlamies pastiprināt, tas norāda, ka šī primeru pāra specifika ir lieliska!(Piemēram, šis ir vienīgais primārā vaicājuma rezultāts!)

05 Primer kvalitātes spriedums
Kāda veida gruntējums ir “ideāls” gruntējums, kas apvieno “pastiprināšanas efektivitāti līdz standartam”, “pastiprinātas produkta īpašības” un “uzticamus eksperimentālos rezultātus”?
Pastiprināšanas efektivitāte

kušanas līkne
Primeru amplifikācijas efektivitāte sasniedz 90% -110%, kas nozīmē, ka pastiprināšanas efektivitāte ir laba, un kušanas līknei ir viens maksimums un parasti Tm> 80 ° C, kas nozīmē, ka amplifikācijas specifika ir laba.
 
Saistītie produkti:
Reāllaika PCR Easy — SYBR GREEN I
Reālā laika PCR Easy-Taqman