Reālā laika PCR, kas pazīstams arī kā kvantitatīvā PCR vai qPCR, ir metode PCR pastiprināšanas produktu reāllaika uzraudzībai un analīzei.
Tā kā kvantitatīvās PCR priekšrocības ir vienkārša darbība, ātra un ērta, augsta jutība, laba atkārtojamība un zems piesārņojuma līmenis, to plaši izmanto medicīniskajā pārbaudē, zāļu efektivitātes novērtēšanā, gēnu ekspresijas pētījumos, transgēnu pētījumos, gēnu noteikšanā, patogēnu noteikšanā, dzīvnieku un augu noteikšanā., pārtikas testēšana un citas jomas.
Tāpēc neatkarīgi no tā, vai jūs nodarbojaties ar fundamentālajiem pētījumiem dzīvības zinātnēs, vai farmācijas uzņēmumu, lopkopības uzņēmumu, pārtikas uzņēmumu darbinieki vai pat ievešanas-izvešanas inspekcijas un karantīnas biroju, vides uzraudzības nodaļu, slimnīcu un citu struktūrvienību darbinieki, jūs vairāk vai mazāk būsiet pakļauti vai jums jāzina kvantitatīvās PCR apguves zināšanas.

Reālā laika PCR princips

Reālā laika PCR ir metode, kurā PCR reakcijas sistēmai tiek pievienotas fluorescējošas vielas, un fluorescences signāla intensitāte PCR reakcijas procesā tiek kontrolēta reāllaikā ar kvantitatīvu PCR instrumentu, un visbeidzot tiek analizēti un apstrādāti eksperimentālie dati.

【Pastiprināšanas līkne】ir līkne, kas apraksta PCR dinamisko procesu.PCR pastiprināšanas līkne faktiski nav standarta eksponenciālā līkne, bet gan sigmoidālā līkne.

[Pastiprināšanas līknes platformas fāze]Palielinoties PCR ciklu skaitam, DNS polimerāzes inaktivācijai, dNTP un praimeru izsīkšanai un sintēzes reakcijas kavēšanai ar reakcijas blakusproduktu pirofosfātu utt., PCR ne vienmēr paplašinās eksponenciāli., un galu galā ieies plato.

[Amplifikācijas līknes eksponenciālās izaugsmes reģions]Lai gan plato fāze ir ļoti atšķirīga, noteiktā amplifikācijas līknes eksponenciālās augšanas reģiona reģionā atkārtojamība ir ļoti laba, kas ir ļoti svarīga PCR kvantitatīvā analīze.

[Sliekšņa vērtība un Ct vērtība]Mēs iestatījām fluorescences noteikšanas robežvērtību attiecīgajā amplifikācijas līknes eksponenciālās augšanas apgabalā, proti, sliekšņa vērtību (Threshold).Sliekšņa vērtības un pastiprinājuma līknes krustpunkts ir Ct vērtība, tas ir, Ct vērtība attiecas uz ciklu skaitu (sliekšņa cikls), kad tiek sasniegta sliekšņa vērtība.

Zemāk esošajā grafikā skaidri parādīta saistība starp sliekšņa līniju un pastiprināšanas līkni, slieksni un Ct vērtību.

【Kā kvantitatīvi noteikt?】

Matemātiskā teorija ir pierādījusi, ka Ct vērtībai ir apgriezta lineāra sakarība ar sākotnējo šablonu skaita logaritmu.Reāllaika PCR uzrauga PCR amplifikācijas produktus reāllaikā un kvantitatīvi nosaka to eksponenciālās pastiprināšanas fāzē.

Katram PCR ciklam DNS eksponenciāli palielinājās 2 reizes un drīz sasniedza plato.

Pieņemot, ka sākuma DNS daudzums ir A₀ , pēc n cikliem DNS produkta teorētisko daudzumu var izteikt šādi:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Tad, jo lielāks ir sākotnējais DNS daudzums A 0, jo ātrāk amplificētā produkta daudzums sasniedz noteikšanas vērtību An, un ciklu skaits, sasniedzot An, ir Ct vērtība.Tas ir, jo lielāks ir sākotnējais DNS daudzums A 0, jo agrāk amplifikācijas līkne sasniedz maksimumu un attiecīgi mazāks ir nepieciešamais ciklu skaits n.

Mēs veicam zināmās koncentrācijas standarta gradienta atšķaidīšanu un izmantojam to kā reāllaika PCR veidni, un ar vienādiem intervāliem tiks iegūta virkne amplifikācijas līkņu DNS sākuma secībā no lielāka uz mazāku.Saskaņā ar lineāro saistību starp Ct vērtību un sākuma šablonu skaita logaritmu, a[standarta līkne] var izveidot .

Aizvietojot parauga ar nezināmu koncentrāciju Ct vērtību standarta līknē, var iegūt sākotnējo šablona daudzumu paraugam ar nezināmu koncentrāciju, kas ir reālā laika PCR kvantitatīvais princips.

Reālā laika PCR noteikšanas metode

Reālā laika PCR nosaka PCR amplifikācijas produktus, nosakot fluorescences intensitāti reakcijas sistēmā.

Fluorescējošās krāsas iegulšanas metodes princips】

Fluorescējošas krāsvielas, piemēram, TB Green®, PCR sistēmās var nespecifiski saistīties ar divpavedienu DNS un pēc saistīšanās fluorescē.

Fluorescences intensitāte reakcijas sistēmā pieauga eksponenciāli, palielinoties PCR cikliem.Nosakot fluorescences intensitāti, DNS amplifikācijas daudzumu reakcijas sistēmā var uzraudzīt reāllaikā, un pēc tam var apgriezti novērtēt sākuma šablona daudzumu paraugā.

【Fluorescējošās zondes metodes princips】

fluorescējošā zondeir nukleīnskābes sekvence ar fluorescējošu grupu 5' galā un slāpējošu grupu 3' galā, kas var specifiski saistīties ar veidni.Kad zonde ir neskarta, fluorofora izstarotā fluorescence tiek dzēsta ar dzēšanas grupu, un tā nevar fluorescēt.Kad zonde sadalās, fluorescējošā viela sadalīsies un izstaros fluorescenci.

PCR reakcijas šķīdumam pievieno fluorescējošu zondi.Atkausēšanas procesa laikā fluorescējošā zonde saistās ar veidnes īpašo pozīciju.Pagarināšanas procesa laikā PCR enzīma 5′→3′ eksonukleāzes aktivitāte var sadalīt fluorescējošo zondi, kas hibridizēta ar veidni, un fluorescējošā viela tiek atdalīta, lai emitētu fluorescenci.Nosakot zondes fluorescences intensitāti reakcijas sistēmā, var sasniegt mērķi kontrolēt PCR produkta amplifikācijas daudzumu.

【Fluorescences noteikšanas metodes izvēle】

Ja to izmanto, lai atšķirtu sekvences ar augstu homoloģiju un veiktu multipleksu PCR noteikšanu, piemēram, SNP tipēšanas analīzi, fluorescējošās zondes metode ir neaizvietojama.
Citiem reāllaika PCR eksperimentiem var izmantot vienkāršu, vieglu un zemu izmaksu fluorescējošās himēras metodi.

zondesSpēcīga specifika, kas spēj veikt multipleksu PCR

Trūkums

Augstas specifikācijas prasības pastiprināšanai;

multiplekso PCR nevar veikt Nepieciešams izstrādāt specifiskas zondes, augstas izmaksas;

dažreiz zondes projektēšana ir sarežģīta

Saistītie produkti: