Atklāšanas specifika
Vairumā gadījumu primera dizaina mērķis ir maksimāli palielināt PCR specifiku.To nosaka daudzu mainīgo vairāk vai mazāk paredzama ietekme.Viens svarīgs mainīgais ir secība grunts 3′galā.
Svarīgi, ka PCR testi, kas paredzēti specifiskumam, visticamāk saglabās augstu efektivitāti plašā dinamiskā diapazonā, jo tests nerada nespecifiskus amplifikācijas produktus, tādējādi konkurējot ar PCR reaģentiem vai kavējot galveno amplifikācijas reakciju.
Protams, atsevišķos gadījumos specifika nav svarīgākā, piemēram, ja mērķis ir kvantitatīvi noteikt cieši saistītus, bet atšķirīgus patogēnus, ir nepieciešami īpaši projektēšanas, optimizācijas un verifikācijas standarti.
Kušanas līkne ir standarta metode, lai novērtētu amplikonu specifiku, vismaz attiecībā uz to, vai pastiprināt vienu mērķi.Tomēr jāuzsver, ka kušanas līknes var būt maldinošas, jo, piemēram, tās var ietekmēt suboptimālu primeru un zemu šablonu koncentrāciju kombinētā iedarbība.
P5 |Kušanas līkne parāda Tm nobīdes, kas iegūtas, konstatējot divus dažādu daudzumu divu mērķa DNS.
A. Pie augstākām koncentrācijām (ad)) pēc qPCR mērījuma pabeigšanas nav acīmredzama primer dimēra.Veidnes koncentrācijai samazinoties līdz 50 kopijām (e), sāk parādīties nespecifisks produkts un kļūst par vienīgo produktu ar zemāko koncentrāciju (f).
B. Pārbaudē tika reģistrēts vienāds Tms pie visām mērķa koncentrācijām, un nebija acīmredzama praimera dimēra pat pie zemākās koncentrācijas (5 kopijas).Izmantojot šīs divas noteikšanas metodes, NTC netika atklāti amplifikācijas produkti.
P5 parāda šķīdināšanas līknes, kas iegūtas ar paraugiem, kuros veidne atrodas dažādās koncentrācijās.P 5a parāda, ka divās zemākajās koncentrācijās saražoto nespecifisko amplifikācijas produktu Tms ir zemāks nekā specifiskajiem amplikoniem.
Acīmredzot šo noteikšanas metodi nevar droši izmantot, lai noteiktu mērķus, kas pastāv zemā koncentrācijā.
Interesanti, ka NTC, ti, paraugi bez DNS, nereģistrēja (nespecifiskus) amplifikācijas produktus, norādot, ka fona genoma DNS var piedalīties nespecifiskā amplifikācijā/polimerizācijā.
Dažreiz šādus fona praimerus un nespecifisku amplifikāciju nevar novērst, taču bieži vien ir iespējams izstrādāt noteikšanas metodi, kurai nav nespecifiskas amplifikācijas nevienā šablona koncentrācijā un NTC (P 5b).
Šeit pat mērķa koncentrācijas pastiprinājuma reģistrēšana ar Cq 35 radīs īpašu izšķīšanas līkni.Tāpat NTC neuzrādīja nespecifiskas amplifikācijas pazīmes.Dažreiz noteikšanas uzvedība var būt atkarīga no mātes šķīduma, un noteiktos bufera sastāvos tiek konstatēta tikai nespecifiska amplifikācija, kas var būt saistīta ar dažādām Mg2+ koncentrācijām.
Atklāšanas stabilitāte
Ta optimizācija ir noderīgs solis qPCR noteikšanas empīriskās pārbaudes un optimizācijas procesā.Tas nodrošina tiešu norādi par primer komplekta noturību, parādot temperatūru (vai temperatūras diapazonu), kas rada zemāko Cq, nepastiprinot NTC.
Divas līdz četras reizes atšķirība jutībā var nebūt svarīga cilvēkiem ar augstu mRNS ekspresiju, bet diagnostikas testos tas var nozīmēt atšķirību starp pozitīvajiem un viltus negatīvajiem rezultātiem.
qPCR primeru Ta īpašības var ievērojami atšķirties.Daži testi nav ļoti stabili, un, ja tie netiek veikti zem optimālās primeru Ta vērtības, tie ātri sabruks.
Tas ir svarīgi, jo šāda veida noteikšana bieži ir problemātiska reālajā pasaulē, un parauga tīrība, DNS koncentrācija vai citu DNS klātbūtne var nebūt optimāla.
Turklāt mērķa kopijas skaits var atšķirties plašā diapazonā, un reaģenti, plastmasas piederumi vai instrumenti var atšķirties no tiem, kas tika izmantoti, uzstādot testu.
P6|Temperatūras gradients parāda atšķirīgo PCR noteikšanas robustumu.
A. Izmantojiet Bioline Sensifast SYBR mastermix (kataloga numurs BIO-98050), lai veiktu PCR cDNS, kas sagatavots no cilvēka smadzeņu RNS.
B. Izmantojiet Bio-Rad CFX qPCR instrumentu, lai reģistrētu apalēna amplifikācijas karti un izšķīšanas līkni (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. ACSBG1 amplifikācijas grafiks un kušanas līkne (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. GFAP amplifikācijas grafiks un izšķīšanas līkne (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).
E. Cqs, kas reģistrētas dažādās atlaidināšanas temperatūrās, parādot Cq starpību, kas reģistrēta 7C temperatūras gradientā.
P 6 parāda tipisku nevēlama testa rezultātu, kur qPCR tika veikts, izmantojot Tas gradientu starp 59C un 67C (P 6a), izmantojot primerus trim cilvēka smadzenēm specifiskiem gēniem.
No amplifikācijas grafika var redzēt, ka Opalin primeri ir tālu no ideāla, jo to optimālais Ta diapazons ir ļoti šaurs (6.b attēls), tas ir, Cqs ir plaši izkliedēti, kā rezultātā Cqs ir ievērojami salīdzinātas ar to optimālo Cqs Low.
Šī noteikšanas metode ir nestabila un var izraisīt suboptimālu pastiprinājumu.Tāpēc šis gruntskrāsu pāris ir jāpārveido.Turklāt kušanas līknes analīze (ielaidums) parāda, ka arī šīs noteikšanas metodes specifika var būt problemātiska, jo katra Ta kušanas līkne ir atšķirīga.
ACSBG1 noteikšanas metode, kas parādīta attēlā P 6c, ir stabilāka nekā iepriekš minētā Opalin noteikšanas metode, taču tā joprojām ir tālu no ideāla, un, visticamāk, to var uzlabot.
Tomēr mēs uzsveram, ka nav nepieciešama saikne starp robustumu un specifiskumu, jo ar šo noteikšanas metodi iegūtā šķīdināšanas līkne parāda vienādu maksimālo vērtību visās Tas (ielaidumā).
No otras puses, robustuma tests ir daudz tolerantāks, radot līdzīgus Cq plašā Tas diapazonā, kā tas ir GFAP testā, kas parādīts P 6d.
Cqs atšķirība, kas iegūta tajā pašā 8 grādu pēc Celsija diapazonā, ir mazāka par 1, un šķīdināšanas līkne (ielaidums) apstiprina noteikšanas raksturlielumus šajā temperatūras diapazonā.Ir vērts atzīmēt, ka aprēķinātais Tas un faktiskais Ta diapazons var ļoti atšķirties.
Ir daudz vadlīniju, kas izstrādātas, lai palīdzētu pētniekiem izstrādāt efektīvus primerus, no kuriem lielākā daļa ir balstīti uz sen pieņemtiem noteikumiem, un liela uzmanība ir pievērsta gruntskrāsu 3′galam.Bieži tiek ieteikts iekļaut G vai C 3' galā un divas G vai C bāzes (GC skava), bet ne vairāk kā divas no pēdējām 5 bāzēm.
Praksē šie noteikumi var vadīt pētniekus, taču tie ne vienmēr ir pareizi visos apstākļos.
P7 |Praimera 3′galam ir maza ietekme uz specifiku vai efektivitāti.
A. Cilvēka HIF-1α (NM_181054.2) gēna praimeru atrašanās vieta.
B. Izmantojiet Agilent Brilliant III SYBR Green mātes šķidrumu (kat. Nr. 600882), lai pastiprinātu sešus testa vienumus.
C. Pastiprināšanas grafiks un kušanas līkne, kas reģistrēta ar Bio-Rad CFX qPCR instrumentu un 3′galu primeriem.NTC ir parādīti sarkanā krāsā.
D. Cqs ieraksts par katru testa priekšmetu
Piemēram, rezultāts P 7 ir pretrunā ar 3′gala noteikumu.Visi modeļi rada būtībā vienādus rezultātus, tikai ar divām primeru kombinācijām, kas noved pie nespecifiskas pastiprināšanas NTC.
Tomēr mēs nevaram atbalstīt GC klipa efektu, jo šajā gadījumā A vai T izmantošana kā maksimums 30 bāzes nesamazina specifiku.
C tests, kurā F primer beidzas ar GGCC, ierakstīja Cqs NTC, norādot, ka varētu vēlēties izvairīties no šīm sekvencēm 30. galā.Mēs uzsveram, ka vienīgais veids, kā noteikt primeru pāra labāko 3′galu secību, ir eksperimentāli novērtēt dažus primerus.
Pastiprināšanas efektivitāte
Svarīgi ir tas, ka, lai gan nespecifiskā PCR noteikšana nekad nevar kļūt specifiska, amplifikācijas efektivitāti var pielāgot un maksimāli palielināt dažādos veidos, mainot fermentu, mātes šķidrumu, piedevas un cikla apstākļus.
Lai novērtētu PCR noteikšanas efektivitāti, vislabāk ir izmantot sērijveida atšķaidījumu, kas ir 10 vai 5 reizes lielāks par mērķa nukleīnskābi, tas ir, “standarta līknes metodi”.
Ja standarta līknes ģenerēšanai tiek izmantoti PCR amplikoni vai sintētiskie DNS mērķi, šo mērķu sērijveida atšķaidījumi jāsajauc ar nemainīgu fona DNS daudzumu (piemēram, genoma DNS).
P8 |Atšķaidīšanas līkne, lai novērtētu PCR efektivitāti.
A. Izmantojiet HIF-1 primerus: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA un R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC un Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (kataloga numurs 600882) PCR un kušanas līknes apstākļiem.
B. 100 ng RNS tika reversi transkribēta, atšķaidīta 2 reizes, un sērijveidā atšķaidīti cDNS paraugi tika atšķaidīti 5 reizes līdz 1 ng cilvēka genoma DNS.Kušanas līkne ir parādīta ielaidumā.
C. RT reakcija, atšķaidīšana un sērijveida atšķaidīšana tika atkārtota otrajam cDNS paraugam, un rezultāti bija līdzīgi.
P 8 parāda divas standarta līknes, izmantojot vienu un to pašu noteikšanas metodi diviem dažādiem cDNS paraugiem, rezultāts ir vienāda efektivitāte, aptuveni 100%, un arī R2 vērtība ir līdzīga, tas ir, atbilstības pakāpe starp eksperimentālajiem datiem un regresijas līniju vai datu linearitātes pakāpe.
Abas standarta līknes ir salīdzināmas, bet ne gluži vienādas.Ja mērķis ir precīzi kvantitatīvi noteikt mērķi, jāņem vērā, ka ir nepieņemami sniegt kopiju skaita aprēķinu, nepaskaidrojot nenoteiktību.
P9 |Mērījumu nenoteiktība, kas saistīta ar kvantitatīvo noteikšanu, izmantojot standarta līkni.
A. Izmantojiet primerus GAPDH (NM_002046), lai veiktu PCR un kušanas līknes apstākļus.F: ACAGTTGCCATGTAGACC un R: TAACTGGTTGAGCACAGG un Bioline's Sensifast SYBR mastermix (kataloga numurs BIO-98050).
B. Pastiprināšanas diagramma, kušanas līkne un standarta līkne, kas reģistrēta ar Bio-Rad CFX qPCR instrumentu.
C. Standarta līknes grafiks un 95% ticamības intervāls (TI).
D. Kopiju skaits un 95% ticamības intervāls trim Cq vērtībām, kas iegūtas no atšķaidīšanas līknes.
P 9 parāda, ka optimizētam testam vienas standarta līknes raksturīgā mainība ir aptuveni 2 reizes (95% ticamības intervāls, no minimālā līdz maksimālajam), kas var būt mazākā mainīgums, ko var sagaidīt.
Saistīts produkts:
Mouse Tail Direct PCR komplekts
Animal Tissue Direct PCR komplekts
Izlikšanas laiks: 30. septembris 2021
