RT-qPCR ir izstrādāts no parastās PCR tehnoloģijas.Tā pievieno fluorescējošas ķimikālijas (fluorescējošas krāsvielas vai fluorescējošas zondes) tradicionālajai PCR reakcijas sistēmai un nosaka PCR atkausēšanas un pagarināšanas procesu reāllaikā atbilstoši to dažādajiem luminiscences mehānismiem.Fluorescējošā signāla izmaiņas vidē tiek izmantotas, lai aprēķinātu produkta izmaiņu apjomu katrā PCR ciklā.Pašlaik visizplatītākās metodes ir fluorescējošās krāsas metode un zondes metode.

Fluorescējošās krāsošanas metode:
Dažas dienasgaismas krāsvielas, piemēram, SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO u.c., pašas par sevi neizstaro gaismu, bet izstaro fluorescenci pēc saistīšanās ar dsDNS mazāko rievu.Tāpēc PCR reakcijas sākumā iekārta nevar noteikt fluorescējošu signālu.Kad reakcija virzās uz atkvēlināšanas-paplašināšanas (divpakāpju metode) vai pagarināšanas stadiju (trīspakāpju metode), šajā laikā tiek atvērtas dubultās virknes un jaunā DNS polimerāze Virknes sintēzes laikā fluorescējošās molekulas tiek apvienotas dsDNS mazajā rievā un izstaro fluorescenci.Palielinoties PCR ciklu skaitam, arvien vairāk krāsvielu apvienojas ar dsDNS, un arī fluorescējošais signāls tiek nepārtraukti uzlabots.Kā piemēru ņemiet SYBR Green Ⅰ.
Zondes metode:
Taqman zonde ir visbiežāk izmantotā hidrolīzes zonde.Zondes 5′ galā ir fluorescējoša grupa, parasti FAM.Pati zonde ir secība, kas papildina mērķa gēnu.Fluorofora 3′ galā ir fluorescējoša dzēšanas grupa.Saskaņā ar fluorescences rezonanses enerģijas pārneses principu (Förster resonance energy transfer, FRET), kad ziņotāja fluorescējošā grupa (donora fluorescējošā molekula) un slāpējošā fluorescējošā grupa (akceptora fluorescējošā molekula) Kad ierosmes spektrs pārklājas un attālums ir ļoti tuvs (7-10 nm) donora fluorescenta akceptētajā molekulā. ule, kamēr autofluorescence ir novājināta.Tāpēc PCR reakcijas sākumā, kad zonde ir brīva un neskarta sistēmā, reportiera fluorescējošā grupa neizstaro fluorescenci.Atkausējot, gruntējums un zonde saistās ar veidni.Pagarināšanas posmā polimerāze nepārtraukti sintezē jaunas ķēdes.DNS polimerāzei ir 5′-3′ eksonukleāzes aktivitāte.Sasniedzot zondi, DNS polimerāze hidrolizēs zondi no veidnes, atdalīs reportiera fluorescējošo grupu no slāpētājas fluorescējošās grupas un atbrīvos fluorescējošu signālu.Tā kā starp zondi un veidni pastāv savstarpēja saistība, zondes metode testa precizitātes un jutīguma ziņā ir pārāka par krāsvielu metodi.

1. attēls qRT-PCR princips

Grunts dizains
Principi:

Praimeriem jābūt veidotiem nukleīnskābju sērijas konservētajā reģionā, un tiem jābūt specifiskiem.

Vislabāk ir izmantot cDNS secību, un arī mRNS secība ir pieņemama.Ja nē, noskaidrojiet DNS sekvences cds reģiona dizainu.
Fluorescējošā kvantitatīvā produkta garums ir 80–150 bp, garākais ir 300 bp, primera garums parasti ir no 17 līdz 25 bāzēm, un atšķirība starp augšpus un lejpus esošajiem primeriem nedrīkst būt pārāk liela.

G+C saturs ir no 40% līdz 60%, un vislabākais ir 45–55%.
TM vērtība ir no 58 līdz 62 grādiem.
Centieties izvairīties no praimeru dimēriem un pašdimēriem, (neparādās vairāk kā 4 secīgu komplementāru bāzu pāri) matadata struktūra, ja tas ir neizbēgams, izveidojiet ΔG<4,5kJ/mol* Ja nevarat nodrošināt, ka gDNS ir noņemts reversās transkripcijas laikā Clean, vislabāk ir veidot primerus no apgabala, kurā ir modificēts, bagātināts introns un T nevar izvairīties *3 /C, A/G nepārtrauktas struktūras (2-3) grunti un ne
specifiska Heterogēni pastiprinātas sekvences homoloģija vēlams ir mazāka par 70% vai tai ir 8 komplementāras bāzes homoloģija.
Datu bāze:
CottonFGD meklēšana pēc atslēgvārdiem
Grunts dizains:
IDT-qPCR primer dizains

2. attēls IDT tiešsaistes gruntskrāsu projektēšanas rīka lapa

Fig3 rezultātu lapas displejs
LncRNS primeru dizains:
lncRNS:tādas pašas darbības kā mRNS.
miRNA:Cilmes cilpas metodes princips: Tā kā visas miRNS ir īsas sekvences ar aptuveni 23 nt, tiešo PCR noteikšanu nevar veikt, tāpēc tiek izmantots cilmes cilpas secības rīks.Stublāju cilpas secība ir aptuveni 50 nt vienpavedienu DNS, kas pati par sevi var veidot matadata struktūru.3 'Galu var veidot kā secību, kas komplementāra miRNS daļējam fragmentam, pēc tam mērķa miRNS var savienot ar cilmes cilpas secību reversās transkripcijas laikā, un kopējais garums var sasniegt 70 bp, kas atbilst amplificētā produkta garumam, ko nosaka qPCR.Astes miRNA primer dizains.
Pastiprinājuma noteikšana:
Tiešsaistes sprādzienu datubāze: CottonFGD sprādziens pēc secības līdzības
Vietējais sprādziens: skatiet informāciju par Blast+ izmantošanu, lai veiktu vietējo blastu, Linux un Macos var tieši izveidot vietējo datu bāzi, win10 sistēmu var veikt arī pēc ubuntu bash instalēšanas.Izveidot lokālo blastu datubāzi un lokālo sprādzienu;atveriet ubuntu bash operētājsistēmā win10.
Piezīme: kalnu kokvilna un jūras salu kokvilna ir tetraploīdas kultūras, tāpēc sprādziena rezultāts bieži vien būs divi vai vairāki sērkociņi.Agrāk, izmantojot NAU cds kā datubāzi spridzināšanas veikšanai, iespējams, tiks atrasti divi homologi gēni ar tikai dažām SNP atšķirībām.Parasti abus homologos gēnus nevar atdalīt ar primera dizainu, tāpēc tos uzskata par vienādiem.Ja ir acīmredzama indel, primer parasti tiek veidots uz indel, bet tas var novest pie grunts sekundārās struktūras. Brīvā enerģija kļūst lielāka, kas noved pie pastiprināšanas efektivitātes samazināšanās, bet tas ir neizbēgami.

Primer sekundārās struktūras noteikšana:
Darbības:atvērt oligo 7 → ievades veidnes secība → aizvērt apakšlogu → saglabāt → veidnē atrast primeri, nospiediet taustiņu kombināciju ctrl+D, lai iestatītu primera garumu → analizējiet dažādas sekundārās struktūras, piemēram, pašdimerizācijas korpusu, heterodimēru, matadata, neatbilstību utt. Pēdējie divi attēli 4. attēlā ir primeru testa rezultāti.Priekšējā gruntējuma rezultāts ir labs, nav acīmredzamas dimēra un matadata struktūras, nav nepārtrauktu komplementāru pamatu, un brīvās enerģijas absolūtā vērtība ir mazāka par 4,5, savukārt aizmugurējā grunts rāda nepārtrauktu. 6 bāzes ir komplementāras, un brīvā enerģija ir 8,8;turklāt 3′ galā parādās nopietnāks dimērs, un parādās 4 secīgu bāzu dimērs.Lai gan brīvā enerģija nav augsta, 3′ dimērs Chl var nopietni ietekmēt pastiprināšanas specifiku un pastiprināšanas efektivitāti.Turklāt ir jāpārbauda, ​​vai nav matadatas, heterodimēru un neatbilstības.

3. att. oligo7 noteikšanas rezultāti
Pastiprināšanas efektivitātes noteikšana:
PCR reakcijas amplifikācijas efektivitāte nopietni ietekmē PCR rezultātus.Arī qRT-PCR amplifikācijas efektivitāte ir īpaši svarīga kvantitatīvajiem rezultātiem.Reakcijas buferī izņemiet citas vielas, iekārtas un protokolus.Praimeru kvalitātei ir arī liela ietekme uz qRT-PCR amplifikācijas efektivitāti.Lai nodrošinātu rezultātu precizitāti, gan relatīvās fluorescences kvantitatīvajā noteikšanā, gan absolūtajā fluorescences kvantitatīvā noteikšanā ir jānosaka praimeru amplifikācijas efektivitāte.Ir atzīts, ka efektīvā qRT-PCR pastiprināšanas efektivitāte ir no 85% līdz 115%.Ir divas metodes:
1. Standarta līknes metode:
a.Sajauciet cDNS
b.Gradienta atšķaidīšana
c.qPCR
d.Lineārās regresijas vienādojums, lai aprēķinātu pastiprināšanas efektivitāti
2. LinRegPCR
LinRegPCR ir programma reāllaika RT-PCR datu analīzei, ko sauc arī par kvantitatīviem PCR (qPCR) datiem, pamatojoties uz SYBR Green vai līdzīgu ķīmiju.Programma izmanto datus, kas nav koriģēti sākotnējā līmenī, veic bāzes līnijas korekciju katram paraugam atsevišķi, nosaka linearitātes logu un pēc tam izmanto lineārās regresijas analīzi, lai ietilpinātu taisnu līniju caur PCR datu kopu.No šīs līnijas slīpuma aprēķina katra atsevišķā parauga PCR efektivitāti.Vidējo PCR efektivitāti uz amplikonu un Ct vērtību vienam paraugam izmanto, lai aprēķinātu sākuma koncentrāciju vienam paraugam, kas izteikta patvaļīgās fluorescences vienībās.Datu ievade un izvade notiek, izmantojot Excel izklājlapu.Tikai paraugs
ir nepieciešama sajaukšana, nav gradienta
ir nepieciešami soļi:(Ņemiet par piemēru Bole CFX96, ne gluži Machine ar skaidru ABI)
eksperiments:tas ir standarta qPCR eksperiments.
qPCR datu izvade:LinRegPCR var atpazīt divus izvadfailu veidus: RDML vai kvantifikācijas pastiprināšanas rezultātu.Faktiski tā ir mašīnas cikla numura un fluorescences signāla noteikšanas vērtība reāllaikā, un pastiprinājumu iegūst, analizējot lineārā segmenta efektivitātes fluorescences izmaiņu vērtību.
Datu atlase: Teorētiski RDML vērtībai jābūt lietojamai.Tiek lēsts, ka mana datora problēma ir tā, ka programmatūra nevar atpazīt RDML, tāpēc man ir Excel izvades vērtība kā sākotnējie dati.Vispirms ieteicams veikt aptuvenu datu pārbaudi, piemēram, paraugu pievienošanas kļūme utt. Punktus var dzēst izvaddatos (protams, jūs nevarat tos izdzēst, LinRegPCR ignorēs šos punktus vēlāk)

5. attēls qPCR datu eksportēšana

6. att. kandidātu paraugu atlase

Datu ievade:Atveriet kvalifikācijas pastiprināšanas rezultātus.xls, → atveriet LinRegPCR → failu → nolasīt no Excel → atlasiet parametrus, kā parādīts 7. attēlā → OK → noklikšķiniet uz noteikt bāzes līnijas

7. att. linRegPCR datu ievades soļi

Rezultāts:Ja nav atkārtošanās, grupēšana nav nepieciešama.Ja notiek atkārtošanās, grupējumu var rediģēt izlases grupā, un identifikatorā tiek ievadīts gēna nosaukums, un tad tas pats gēns tiks automātiski grupēts.Visbeidzot noklikšķiniet uz faila, eksportējiet programmu Excel un skatiet rezultātus.Tiks parādīta katras iedobes pastiprināšanas efektivitāte un R2 rezultāti.Otrkārt, sadalot grupās, tiks parādīta koriģētā vidējā pastiprinājuma efektivitāte.Pārliecinieties, ka katra primera pastiprināšanas efektivitāte ir no 85% līdz 115%.Ja tas ir pārāk liels vai pārāk mazs, tas nozīmē, ka grunts pastiprināšanas efektivitāte ir slikta.

8. attēls Rezultāts un datu izvade

Eksperimentālais process:
RNS kvalitātes prasības:
Tīrība:1.72,0 norāda, ka var būt izotiocianāta atliekas.Tīrai nukleīnskābei A260/A230 jābūt aptuveni 2 . Ja pie 230 nm ir spēcīga absorbcija, tas norāda, ka ir organiski savienojumi, piemēram, fenāta joni.Turklāt to var noteikt ar 1,5% agarozes gēla elektroforēzi.Norādiet marķieri, jo ssRNS nav denaturācijas un molekulmasas logaritmam nav lineāras attiecības, un molekulmasu nevar pareizi izteikt.Koncentrācija: Teorētiskinēmazāk nekā 100 ng/ul, ja koncentrācija ir pārāk zema, tīrība parasti ir zema, nevis augsta

9. att. RNS gēls

Turklāt, ja paraugs ir vērtīgs un RNS koncentrācija ir augsta, pēc ekstrakcijas ieteicams to sadalīt alikvotā veidā un atšķaidīt RNS līdz galīgajai koncentrācijai 100–300 ng/ul reversajai transkripcijai.Inreversās transkripcijas process, kad mRNS tiek transkribēts, reversajai transkripcijai tiek izmantoti oligo (dt) praimeri, kas var specifiski saistīties ar poliA astēm, savukārt lncRNS un cirRNS izmanto izlases heksamēra (Random 6 mer) primerus kopējās RNS reversajai transkripcijai.Daudzi uzņēmumi tagad ir laiduši klajā īpašus astes komplektus.Stumbra cilpas metodei astes metode ir ērtāka, ar augstu caurlaidspēju un reaģentu taupīšanu, taču vienas ģimenes miRNS atšķiršanas efektam nevajadzētu būt tik labam kā cilmes cilpas metodei.Katram reversās transkripcijas komplektam ir prasības attiecībā uz gēnu specifisko praimeru (cilmes cilpu) koncentrāciju.Iekšējā atsauce, ko izmanto miRNS, ir U6.Kāta cilpas inversijas procesā U6 caurule ir jāapgriež atsevišķi un tieši jāpievieno U6 priekšējie un aizmugurējie grunti.Gan cirRNS, gan lncRNS var izmantot HKG kā iekšējo atsauci.IncDNS noteikšana,
ja nav problēmu ar RNS, arī cDNS vajadzētu būt kārtībā.Tomēr, ja tiek mēģināts panākt eksperimenta pilnību, vislabāk ir izmantot iekšējo atsauces gēnu (references gēns, RG), kas var atšķirt gDNS no CD.Parasti RG ir mājturības gēns., HKG), kā parādīts 10. attēlā;Tajā laikā es gatavoju sojas pupu uzglabāšanas proteīnu un kā iekšējo atsauci izmantoju aktīnu7, kas satur intronus.Šī primera pastiprinātā fragmenta izmērs gDNS bija 452 bp, un, ja cDNS tika izmantots kā veidne, tas bija 142 bp.Pēc tam testa rezultāti atklāja, ka daļa no cDNS faktiski ir piesārņota ar gDNS, un tas arī pierādīja, ka ar reversās transkripcijas rezultātu nav problēmu, un to var izmantot kā veidni PCR.Ir bezjēdzīgi vadīt agarozes gēla elektroforēzi tieši ar cDNS, un tā ir izkliedēta josla, kas nepārliecina.

10. attēls cDNS noteikšana

qPCR apstākļu noteikšanasaskaņā ar komplekta protokolu parasti nav problēmu, galvenokārt tm vērtības solī.Ja daži primeri nav pareizi izstrādāti primera projektēšanas laikā, kā rezultātā rodas liela atšķirība starp tm vērtību un teorētisko 60°C, ieteicams cDNS Pēc paraugu sajaukšanas veikt gradienta PCR ar primeriem un mēģināt izvairīties no temperatūras bez joslām kā TM vērtības iestatīšanas.

Datu analīze

Parastā relatīvās fluorescences kvantitatīvā PCR apstrādes metode pamatā atbilst 2-ΔΔCT.Datu apstrādes veidne.

Saistītie produkti:

Viegli reāllaika PCR^TM – Takmans

Viegli reāllaika PCR^TM –SYBR GREEN I

RT Easy I (galvenais premikss pirmās ķēdes cDNS sintēzei)

RT Easy II (galvenais premikss pirmās kārtas cDNS sintēzei qPCR)