RT-qPCR eksperiments ietver RNS ekstrakciju un kvalitātes novērtēšanu, reverso transkripciju un qPCR trīs soļus, katrā solī ir daudz piesardzības pasākumu, mēs sīkāk iepazīstināsim tālāk.

Ⅰ.RNS kvalitātes novērtējums

RT-qPCR eksperimentā pēc RNS ekstrakcijas pabeigšanas ir jānovērtē RNS kvalitāte, un turpmāko eksperimentu var veikt tikai pēc tam, kad tas ir kvalificēts.Novērtēšanas metodes ietver spektrofotometru, Agilent gēla elektroforēzi, Agilent 2100 analīzi, tostarp visbiežāk izmantoto spektrofotometru un agarozes gēla elektroforēzes metodi.Jāņem vērā, ka šīs divas metodes ir jāizmanto kopā, lai pabeigtu RNS koncentrācijas, tīrības un integritātes noteikšanu un analīzi, lai nodrošinātu RNS kvalitāti.

Saistītais RNS izolācijas komplekts: 

Šūnu kopējās RNS izolācijas komplekts

Augsti attīrītu un kvalitatīvu kopējo RNS var iegūt no dažādām kultivētām šūnām 11 minūtēs.

Dzīvnieku kopējās RNS izolācijas komplekts

Ātri un efektīvi ekstrahē augstas tīrības un augstas kvalitātes kopējo RNS no dažādiem dzīvnieku audiem.

Spektrofotometrs:

Spektrofotometru galvenokārt izmanto, lai noteiktu RNS koncentrāciju un tīrību, taču tas nevar noteikt RNS un genoma atlikuma integritāti.Tostarp A260/280 un A260/230 ir svarīgi parametri RNS tīrības noteikšanai, un RNS tīrību var noteikt atbilstoši to vērtību svārstībām:

1. 1,9< A260/280< 2,1, kas norāda, ka RNS tīrība ir laba;A260/280<1,9, kas norāda, ka RNS var būt proteīna atlikumi;A260/280>2.1, kas norāda uz iespējamu daļēju RNS noārdīšanos, ko var vēl vairāk apstiprināt ar agarozes gēla elektroforēzi.

2. 2,0< A260/230< 2,2, kas norāda, ka RNS tīrība ir laba;A260/230< 2,0, kas norāda, ka RNS var būt organisko reaģentu atliekas, piemēram, fenoli, etanols vai cukuri.

Agarozes gēla elektroforēze:

Agarozes gēla elektroforēzes tests var analizēt RNS integritāti, genomu un olbaltumvielu atlikumus, bet nevar precīzi noteikt RNS koncentrāciju vai noteikt organisko reaģentu atliekas.Ņemiet, piemēram, eikariotu RNS veidnes:

1. RNS tika pakļauta agarozes gēla elektroforēzei.Ja gēla kartē bija tikai trīs atsevišķas 28sRNS, 18sRNS un 5,8sRNS joslas, tas norāda, ka ekstrahētā RNS ir neskarta.Ja ir vilkšanas parādība, tas norāda uz daļēju RNS degradāciju.

2. Ja starp līmes caurumu un 28sRNS joslu ir viena spilgta josla, var būt genoma DNS atlikums.

3. Ja līmes caurumā parādās joslas, tas norāda, ka tajā var būt olbaltumvielu un citu lielmolekulāru vielu atliekas.

Ⅱ. Reversā transkripcija

Kad RNS ekstrakcija ir pabeigta, tā ir jāpārvērš cDNS turpmākajiem eksperimentiem, tāpēc apvērsuma solis ir būtisks.Reversā transkripcija tiks ieviesta no reversās transkriptāzes un praimera atlases:

Reversās transkriptāzes atlase:

Tipiskās reversās transkriptāzes ietver AMV RTase un MMLV RTase.AMV RTase RNāzei H ir spēcīga aktivitāte, īss sintēzes ilgums, zems sintēzes daudzums un laba termiskā stabilitāte (42 ~ 55 ℃).MMLV RTase RNāzes H aktivitāte ir vāja, sintēzes ilgums ir garš, sintēzes apjoms ir augsts un termiskā stabilitāte ir slikta (37 ~ 42 ℃).

Tā kā RNāzes H enzīmam ir RNS veidnes noārdīšanas funkcija, reversās transkripcijas laikā priekšroka jāizvēlas MMLV ar vāju RNāzes H aktivitāti, un pēc vēlākas gēnu inženierijas MMLV termiskā stabilitāte ir sasniegusi kvalitatīvu lēcienu.Ņemot ForegeneForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV reversajai transkripcijai) Piemēram, tā ir jauna reversā transkriptāze, kas ekspresēta E. coli inženierijas baktērijās, izmantojot ģenētiskās rekombinācijas tehnoloģiju.Tā ir rekombinantā DNS polimerāze, kas sintezē komplementāru DNS virkni no vienpavedienu RNS, DNS vai RNS:DNS hibrīda.Tam nav RNāzes H aktivitātes, spēcīga stabilitāte, spēcīga RNS afinitāte un augsta noteikšanas jutība.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV reversajai transkripcijai)

Gruntskrāsas izvēle:

Parasti RT primeri iedalās trīs kategorijās: oligo dT, izlases primeri un gēniem specifiski primeri.Izvēlieties piemērotus gruntējumus lietošanai atbilstoši dažādām eksperimentālajām prasībām.

1. Ja veidnei ir eikariotu izcelsme un vēlīnā cDNS tiek izmantota rutīnas PCR amplifikācijai, ieteicams izmantot Oligo (dT);Ja nākamo eksperimentu izmanto tikai qPCR, Oligo (dT) ieteicams sajaukt ar nejaušiem primeriem, lai uzlabotu reversās transkripcijas efektivitāti.

2. Ja veidne ir no prokariotiem, reversajai transkripcijai jāizvēlas Random Primers vai gēnu specifiskie primeri.

Ⅲ.qPCR

Fluorescences kvantitatīvā noteikšana galvenokārt tiek izstrādāta, izvēloties kvantitatīvās metodes, primeru projektēšanas principus, ROX izvēli, reakcijas sistēmas konfigurāciju un reakcijas apstākļu iestatījumus utt.

Kvantitatīvo metožu izvēle:

Kvantitatīvās metodes iedala relatīvās kvantitatīvās metodēs un absolūtās kvantitatīvās metodēs.Relatīvo kvantitatīvo noteikšanu var izmantot, lai noteiktu noteiktu ārstēšanas metožu ietekmi uz gēnu ekspresiju, noteiktu gēnu ekspresijas atšķirību dažādos laikos un salīdzinātu gēnu ekspresijas atšķirību dažādos audos.Absolūtā kvantitatīva noteikšana var noteikt vīrusa nukleīnskābes daudzumu utt.Veicot eksperimentus, mums ir jāizvēlas atbilstošas ​​kvantitatīvās metodes atbilstoši mūsu pašu eksperimentiem.

Gruntējuma dizaina principi:

qPCR primera dizains ir tieši saistīts ar amplifikācijas efektivitāti un produkta specifiku.Tāpēc pareiza labu primeru izstrāde ir veiksmīgas qPCR pirmais solis.Izstrādājot gruntskrāsu, jāievēro šādi principi, ievērojot parasto gruntskrāsu dizaina principu:

1. Mērķa fragmenta garums tiek kontrolēts no 100 līdz 300 bp;

2. Cross-exon dizains, lai izvairītos no genoma DNS ietekmes;

3. Izstrādātajiem praimeriem ir jāpārbauda amplifikācijas efektivitāte, un tikai tad, kad amplifikācijas efektivitāte sasniedz standartu (90-110%), tos var izmantot kvantitatīviem eksperimentiem;

4. Primer koncentrācija parasti tiek optimizēta no 0,1 uM līdz 1,0 uM.

Izvēle noROX:

Kvantitatīvās reakcijas procesā ROX var vienmērīgi pielāgot optiskā ceļa atšķirību, pipetes kļūdu vai tilpuma starpību, ko izraisa iztvaikošana un kondensācija, uzlabojot rezultātu atkārtojamību.Tomēr jāatzīmē, ka ROX izvēle ir saistīta ar instrumentu.Ja qPCR instrumentam ir funkcija automātiski koriģēt atšķirību starp caurumiem, tam nav jāpievieno ROX;pretējā gadījumā tai jāpievieno ROX korekcija.Mazajiem partneriem reaģentu iegādē ir jābūt atbilstoši izmantotajam instrumentam, lai izvēlētos pareizo ROX, lai izvairītos no vēlākām kļūdām.

Reakcijas sistēmas sagatavošana:

Vēlams reakcijas tilpums 20 ul un 50 ul.Veidojot sistēmu, jāpievērš uzmanība šādiem jautājumiem:

1. Reakcijas sistēma jāsagatavo ar ventilāciju īpaši tīrā darbagaldā, jauns ddH₂Katram eksperimentam izmanto O;

2. Katram eksperimentam ir jāsagatavo NTC, lai pārbaudītu, vai sistēmā nav piesārņojuma, un katram primeru pārim, sagatavojot sistēmu, ir jāveic NTC;

3. Lai noteiktu, vai RNS šablonā ir gDNS atlikums, katram paraugam var sagatavot NRT noteikšanai;

4. Sagatavojot sistēmu, vienam paraugam ieteicams veikt vismaz 3 tehniskos atkārtojumus;

5. Ja veidne ir cDNS, ieteicams atšķaidīt 5-10 reizes, lai samazinātu reversās transkripcijas sistēmas inhibējošo efektu qPCR eksperimentā.Labāk ir izpētīt veidnes daudzumu pēc gradienta, lai CT vērtība būtu no 20 līdz 30;

6. Noteikt nepieciešamo reakciju skaitu, palielināt par 5-10%, pamatojoties uz reakciju skaitu, un aprēķināt tilpuma konfigurācijas numuru;

7, sistēma ir sagatavota, izmantojot premiksa principu, sajaucot pēc centrifugēšanas un nodrošinot, ka nav burbuļu;

8, pēc iespējas izvēlēties palīgmateriālus.

Saistītais RT-qPCR komplekts