Ir labi zināms, ka centrālajā dogmā RNS ir transkripcijas starpnieks starp DNS un olbaltumvielu ekspresiju.Salīdzinot ar DNS noteikšanu, RNS noteikšana var objektīvāk atspoguļot gēnu ekspresiju organismos.Eksperimenti ar RNS ietver: qRT-PCR, RNA-Seq un saplūsmes gēnu noteikšanu utt. Pamatojoties uz pašas RNS īpašībām (RNS šugaringā ir par vienu brīvu hidroksilgrupu vairāk nekā DNS šugargredzenā), kopā ar lielu skaitu RNāžu vidē, RNS ir nestabilāka un vieglāk noārdāma nekā DNS.Atkritumi iekšā, atkritumi ārā, ja RNS kvalitāte nav laba, tad eksperimenta rezultātiem jābūt neapmierinošiem, kas konkrēti izpaužas kā neprecīzi dati vai slikta atkārtojamība.Tāpēc lielāka uzmanība jāpievērš RNS apstrādei, un arī kvalitātes kontroles saikne ir svarīgāka, lai nodrošinātu turpmāko eksperimentālo datu precizitāti un precizitāti.

RNS kvalitātes kontrolei parasti tiek izmantotas šādas metodes:

• Spektrofotometrija
• agarozes gēla elektroforēze
• Agilent Bioanalyzer
• reālā laika fluorescējošā kvantitatīvā PCR
• Kubit fluorescējošās krāsošanas metode

01 Spektrofotometrija

RNS ir konjugētas dubultās saites, un tās absorbcijas maksimums ir pie viļņa garuma 260 nm.Saskaņā ar Lamberta-Bēra likumu mēs varam aprēķināt RNS koncentrāciju no absorbcijas maksimuma pie 260 nm.Turklāt mēs varam arī aprēķināt RNS tīrību pēc 260 nm, 280 nm un 230 nm absorbcijas maksimumu attiecības.280 nm un 230 nm ir attiecīgi olbaltumvielu un mazo molekulu absorbcijas maksimumi.Kvalificētās RNS tīrības attiecībai A260/A280 un A260/A230 jābūt lielākai par 2. Ja tā ir mazāka par 2, tas nozīmē, ka RNS paraugā ir proteīnu vai mazmolekulāru piesārņojums un tas ir jāattīra vēlreiz.Piesārņojuma avoti ietekmēs pakārtotos eksperimentus, piemēram, kavēs PCR reakciju amplifikācijas efektivitāti, kā rezultātā tiks iegūti neprecīzi kvantitatīvie rezultāti.RNS tīrībai ir liela ietekme uz turpmākajiem rezultātiem, tāpēc spektrofotometrija parasti ir neaizstājama kvalitātes kontroles saite nukleīnskābju eksperimentu pirmajā posmā.

1. attēls. Tipisks RNS/DNS absorbcijas spektrs

02 Agarozes gēla elektroforēze

Papildus tīrībai RNS integritāte ir arī viens no svarīgiem rādītājiem, lai novērtētu RNS kvalitāti.RNS degradācija izraisīs lielu skaitu īsu fragmentu paraugā, tāpēc tiks samazināts to RNS fragmentu skaits, kurus var efektīvi noteikt un aptvert atsauces secībā.RNS integritāti var pārbaudīt ar kopējās RNS elektroforēzi uz 1% agarozes gēla.Izmantojot šo metodi, želeju var konfigurēt pats vai izmantot saliekamo E-Gel™ sistēmu integritātes pārbaudei.Vairāk nekā 80% no kopējās RNS ir ribosomu RNS, no kurām lielākā daļa sastāv no 28S un 18S rRNS (zīdītāju sistēmās).Labas kvalitātes RNS parādīs divas acīmredzamas spilgtas joslas, kas ir attiecīgi 28S un 18S spilgtas joslas, pie 5 Kb un 2 Kb, un attiecība parasti būs tuvu 2:1.Ja tas ir difūzā stāvoklī, tas nozīmē, ka RNS paraugs, iespējams, ir degradējies, un ir ieteicams izmantot vēlāk aprakstīto metodi, lai turpmāk pārbaudītu RNS kvalitāti.

2. attēls. Degradētās (2. josla) un neskartās RNS (3. josla) salīdzinājums agarozes gēla elektroforēzē

03 Agilent Bioanalyzer

Papildus iepriekš aprakstītajai agarozes gēla elektroforēzes metodei, kas var palīdzēt mums vienkārši un ātri noteikt RNS integritāti, mēs varam izmantot arī Agilent bioanalizatoru, lai noteiktu RNS integritāti.Tas izmanto mikrofluidikas, kapilārās elektroforēzes un fluorescences kombināciju, lai novērtētu RNS koncentrāciju un integritāti.Izmantojot iebūvēto algoritmu, lai analizētu RNS parauga profilu, Agilent bioanalizators var aprēķināt atsauces RNS integritātes vērtību, RNS integritātes numuru (turpmāk tekstā — RIN) [1].Jo lielāka ir RIN vērtība, jo augstāka ir RNS integritāte (1 ir ārkārtīgi degradēta, 10 ir vispilnīgākā).Daži eksperimenti ar RNS liecina par RIN izmantošanu kā kvalitātes novērtēšanas parametru.Izmantojot augstas caurlaidības sekvencēšanas eksperimentus (turpmāk tekstā — NGS), Oncomine™ Human Immune Repertuāra vadlīnijas, kas tiek izmantotas B šūnu un T šūnu antigēnu receptoru noteikšanai Thermo Fisher's Oncomine paneļu sērijā, liecina, ka paraugus ar RIN vērtībām, kas lielākas par 4, var izmērīt efektīvākus nolasījumus un klonus3 (Figure).Dažādiem paneļiem ir dažādi ieteicamie diapazoni, un bieži vien lielāks RIN var nodrošināt efektīvākus datus.

3. attēlā Oncomine™ cilvēka imūnrepertuāra eksperimentos paraugi ar RIN lielāku par 4 var noteikt efektīvākus nolasījumus un T šūnu klonus.【2】

Tomēr RIN vērtībai ir arī daži ierobežojumi.Lai gan RIN ir augsta korelācija ar NGS eksperimentālo datu kvalitāti, tas nav piemērots FFPE paraugiem.FFPE paraugi ir ķīmiski apstrādāti ilgu laiku, un ekstrahētajai RNS parasti ir salīdzinoši zema RIN vērtība.Tomēr tas nenozīmē, ka efektīvajiem eksperimenta datiem jābūt neapmierinošiem.Lai precīzi novērtētu FFPE paraugu kvalitāti, mums ir jāizmanto citi mērījumi, nevis RIN.Papildus RIN, Agilent bioanalyzer var arī aprēķināt DV200 vērtību kā RNS kvalitātes novērtēšanas parametru.DV200 ir parametrs, kas RNS paraugā aprēķina to fragmentu proporciju, kas ir lielāki par 200 bp.DV200 ir labāks FFPE parauga kvalitātes rādītājs nekā RIN.FFPE ekstrahētajai RNS tai ir ļoti augsta korelācija ar efektīvi nosakāmo gēnu skaitu un gēnu daudzveidību [3].Lai gan DV200 var kompensēt trūkumus FFPE kvalitātes noteikšanā, Agilent bioanalizators joprojām nevar vispusīgi analizēt RNS paraugu kvalitātes problēmas, tostarp to, vai paraugos ir inhibitori.Paši inhibitori var ietekmēt pakārtoto eksperimentu pastiprināšanas efektivitāti un samazināt noderīgo datu apjomu.Lai uzzinātu, vai paraugā ir inhibitors, mēs varam pieņemt tālāk aprakstīto reālā laika fluorescējošās kvantitatīvās PCR metodi.

04 reālā laika fluorescējošā kvantitatīvā PCR

Reālā laika fluorescējošā kvantitatīvā PCR metode var ne tikai noteikt inhibitorus paraugā, bet arī precīzi atspoguļot RNS kvalitāti FFPE paraugā.Salīdzinot ar Agilent bioloģiskajiem analizatoriem, reāllaika fluorescences kvantitatīvie instrumenti ir populārāki lielākajās bioloģiskajās laboratorijās to plašākas pielietojuma dēļ.Lai pārbaudītu RNS paraugu kvalitāti, mums tikai jāiegādājas vai jāsagatavo praimeru zondes iekšējiem atsauces gēniem, piemēram, GUSB (kat. Nr. Hs00939627).Izmantojot šo praimeru, zondu un standartu komplektu (kopējā RNS ar zināmu koncentrāciju), lai veiktu absolūtos kvantitatīvos eksperimentus, efektīvo RNS fragmentu koncentrāciju var aprēķināt kā RNS kvalitātes novērtēšanas standartu (saīsināti funkcionālā RNS kvantitāte (FRQ).NGS testā mēs atklājām, ka RNS paraugu FRQ ir ļoti augsta korelācija ar efektīvo datu apjomu.Visiem paraugiem, kas ir lielāki par 0,2 ng/uL FRQ, vismaz 70% nolasījumu var efektīvi aptvert atsauces secību (4. attēls).

4. attēlā ar fluorescences kvantitatīvo metodi noteiktajai FRQ vērtībai ir ļoti augsta korelācija (R2>0,9) ar efektīvajiem datiem, kas iegūti NGS eksperimentā.Sarkanā līnija ir FRQ vērtība, kas vienāda ar 0,2 ng/uL (log10 = -0,7).【4】

Papildus tam, ka reālā laika kvantitatīvā PCR metode ir piemērojama FFPE paraugiem, tā var arī efektīvi uzraudzīt inhibitorus paraugos.Mēs varam pievienot nosakāmo paraugu reakcijas sistēmai ar iekšējo pozitīvo kontroli (IPC) un tās testu, un pēc tam veikt fluorescences kvantitatīvo noteikšanu, lai iegūtu Ct vērtību.Ja Ct vērtība atpaliek no Ct vērtības reakcijā bez parauga, tas norāda, ka inhibitors ir paraugā un kavē amplifikācijas efektivitāti reakcijā.

05 Qubit fluorescējošās krāsošanas metode

Qubit Fluorometer ir visbiežāk izmantotā mazā ierīce nukleīnskābju koncentrācijas un tīrības noteikšanai, kas ir viegli lietojama un pastāv gandrīz katrā molekulārās bioloģijas laboratorijā.Tas precīzi aprēķina nukleīnskābes koncentrāciju, nosakot un nukleīnskābi saistošu fluorescējošu krāsu (Qubit noteikšanas reaģentu).Qubit ir augsta jutība un specifiskums, un tas var precīzi noteikt RNS līdz pg/µL koncentrācijai.Papildus labi zināmajai spējai precīzi noteikt nukleīnskābju koncentrāciju, Thermo Fisher jaunākais jaunais modelis Qubit 4.0 var arī noteikt RNS integritāti.Qubit 4.0 RNS noteikšanas sistēma (RNA IQ Assay) nosaka RNS integritāti, vienlaikus nosakot divas specifiskas fluorescējošas krāsvielas.Šīs divas fluorescējošās krāsvielas var saistīties attiecīgi ar lieliem RNS fragmentiem un maziem fragmentiem.Šīs divas fluorescējošās krāsvielas norāda lielo RNS fragmentu īpatsvaru paraugā, un no tā var aprēķināt IQ (Integrity and Quality) vērtību, kas atspoguļo RNS kvalitāti.IQ vērtība ir piemērojama gan FFPE, gan ne-FFPE paraugiem, un tai ir liela ietekme uz turpmāko secības kvalitāti.Ņemot par piemēru NGS eksperimentus, RNA-Seq testa eksperimentos, kas tika veikti uz Ion torrent™ platformas, lielākajai daļai paraugu ar IQ vērtībām, kas lielākas par 4, bija vismaz 50% efektīvas nolasīšanas (5. attēls).Salīdzinot ar iepriekš minētajām noteikšanas metodēm, Qubit IQ Assay ir ne tikai ērtāk darboties un aizņem mazāk laika (piecu minūšu laikā), bet arī ir lieliska korelācija starp izmērīto parametra IQ vērtību un pakārtoto eksperimentu datu kvalitāti.

5. attēlā ir liela korelācija starp Qubit RNA IQ vērtību un kartētajiem RNS-Seq nolasījumiem.【5】

Izmantojot iepriekš minēto ievadu, es uzskatu, ka ikvienam ir pietiekama izpratne par dažādām RNS kvalitātes kontroles metodēm.Praksē jūs varat izvēlētiesatbilstošo metodi atbilstoši izlases veidam un esošajiem instrumentiem.Tikai labi kontrolējot RNS kvalitāti, mēs varam izvairīties no turpmāko eksperimentu neveiksmēm, ko izraisa slikta paraugu kvalitāte, tādējādi ietaupot dārgo laiku, enerģiju un izmaksas.

Atsauces produkti:

Dzīvnieku kopējās RNS izolācijas komplekts

Šūnu kopējās RNS izolācijas komplekts

atsauces

【1】 Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN: RNS integritātes numurs, lai RNS mērījumiem piešķirtu integritātes vērtības.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Oncomine Human Immune Repertuāra lietotāja rokasgrāmata (pub. Nr. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Uzlabota kvalitātes metrika RNS novērtēšanai, kas iegūta no arhīva formalīna fiksēta parafīna iegultiem audu paraugiem, 1. sējums, 2. augusts, 9, 2. augusts. 357.–373. lpp.,https://doi.org/10.1093/toxsci/