Mēs esam bijuši pieredzējis ražotājs.Iegūstot lielāko daļu sava tirgus svarīgo sertifikāciju uzņēmumam “China High Sensitivity One-Step Probe Rt. Lielas atlaides”QpcrKomplekts V2, kvalitāte ir rūpnīcas dzīve, koncentrēšanās uz klientu pieprasījumu ir uzņēmuma izdzīvošanas un attīstības avots, mēs ievērojam godīgumu un godprātīgu darba attieksmi, ceram uz jūsu ierašanos!
Mēs esam bijuši pieredzējis ražotājs.Iegūstot lielāko daļu sava tirgus svarīgo sertifikātuĶīnas Taq DNS polimerāze, Qpcr, Mūsu uzņēmums sola: saprātīgas cenas, īsu ražošanas laiku un apmierinošu pēcpārdošanas servisu, mēs arī laipni aicinām jūs apmeklēt mūsu rūpnīcu jebkurā laikā, kad vēlaties.Novēlu, lai mums tagad ir patīkams un ilgtermiņa kopīgs bizness!!!

Apraksti

Šajā komplektā tiek izmantota unikāla līzes bufera sistēma, kas var ātri atbrīvot RNS no kultivētiem šūnu paraugiem RT-qPCR reakcijām, tādējādi novēršot laikietilpīgo un darbietilpīgo RNS attīrīšanas procesu.RNS veidni var iegūt tikai 7 minūtēs.Komplektā iekļautie 5×Direct RT Mix un 2×Direct qPCR Mix-SYBR reaģenti var ātri un efektīvi iegūt reāllaika kvantitatīvos PCR rezultātus.

5×Direct RT Mix un 2×Direct qPCR Mix-SYBR ir spēcīga inhibitoru tolerance, un paraugu lizātu var izmantot kā veidni tieši RT-qPCR.Šis komplekts satur unikālo RNS augstas afinitātes Foregene reverso transkriptāzi un Hot D-Taq DNS polimerāzi, dNTP, MgCl.₂, reakcijas buferis, PCR optimizētājs un stabilizators.

Specifikācijas

200 × 20 μl Rxns, 1000 × 20 μl Rxns

Komplekta sastāvdaļas

Īpašības un priekšrocības

■ Vienkārši un efektīvi: ar Cell Direct RT tehnoloģiju RNS paraugus var iegūt tikai 7 minūtēs.

■ Izlases pieprasījums ir mazs, var pārbaudīt pat 10 šūnas.

■ Liela caurlaidspēja: tā var ātri noteikt RNS šūnās, kas kultivētas 384, 96, 24, 12, 6 bedrīšu plāksnēs.

■ DNS Eraser var ātri noņemt atbrīvotos genomus, ievērojami samazinot ietekmi uz turpmākajiem eksperimenta rezultātiem.

■ Optimizētā RT un qPCR sistēma padara divpakāpju RT-PCR reverso transkripciju efektīvāku un PCR specifiskāku un izturīgāku pret RT-qPCR reakcijas inhibitoriem.

Komplekta pielietojums

Pielietojuma joma: kultivētas šūnas.

- RNS, kas izdalās parauga līzes rezultātā: attiecas tikai uz šī komplekta RT-qPCR veidni.

- Komplektu var izmantot šādiem mērķiem: gēnu ekspresijas analīzei, siRNS mediētā gēnu klusēšanas efekta pārbaudei, zāļu skrīningam utt.

Diagramma

Uzglabāšana un glabāšanas laiks

Šī komplekta I daļa jāuzglabā 4℃ temperatūrā;II daļa jāuzglabā -20 ℃.

Foregene Protease Plus II jāuzglabā 4 ℃, nesasaldēt -20 ℃.

Reaģents 2×Direct qPCR Mix-SYBR jāuzglabā -20 ℃ tumsā;ja to izmanto bieži, to var uzglabāt arī 4℃ īslaicīgai uzglabāšanai (izlietot 10 dienu laikā). Mums ir pieredzējis ražotājs.Iegūstot lielāko daļu no svarīgākajiem sertifikātiem savā tirgū, lai saņemtu lielas atlaides Ķīnas augstas jutības vienpakāpes zondes Rt-Qpcr komplektam V2, kvalitāte ir rūpnīcas dzīve, koncentrēšanās uz klientu pieprasījumu ir uzņēmuma izdzīvošanas un attīstības avots. Mēs ievērojam godīgumu un godprātīgu darba attieksmi, ar nepacietību gaidot jūsu ierašanos!
Liela atlaideĶīnas Taq DNS polimerāze, Qpcr, Mūsu uzņēmums sola: saprātīgas cenas, īsu ražošanas laiku un apmierinošu pēcpārdošanas servisu, mēs arī laipni aicinām jūs apmeklēt mūsu rūpnīcu jebkurā laikā, kad vēlaties.Novēlu, lai mums tagad ir patīkams un ilgtermiņa kopīgs bizness!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Kat.Nr.DRT-01021/01022

Šūnu tiešai RT-qPCR, izmantojot ≤ 1000 000 šūnas

Produkta ievads

Šis produkts izmanto unikālu līzes bufera sistēmu, lai ātri atbrīvotu RNS no kultivētiem šūnu paraugiem RT-qPCR reakcijām, novēršot laikietilpīgo un darbietilpīgo RNS attīrīšanas procesu, un tikai 7 minūtes, lai iegūtu nepieciešamo RNS veidni, ar 5 × Direct RT Mix, 2 × Direct qPCR Mix-Taqman, ko nodrošina komplekts, ātri iegūstot kvantitatīvus un reāllaika rezultātus.

5× Direct RT Mix un 2× Direct qPCR Mix-Taqman ir spēcīga inhibitoru tolerance un var veikt efektīvu apvērsumu un specifisku pastiprināšanu, izmantojot parauga lizātu, kas jāmēra kā veidni.Reaģents satur Foregene reverso transkriptāzi, Hot D-Taq DNS polimerāzi, dNTP, MgCl₂, reakcijas buferis, PCR optimizētājs un stabilizators, ko var izmantot kopā ar līzes buferi, lai ātri un viegli noteiktu paraugus, un tam piemīt augstas jutības, specifiskuma un stabilitātes īpašības.

Produkta īpašības

Vienkārša, efektīva Cell Direct RT tehnoloģija, kas aizņem tikai 7 minūtes, lai iegūtu RNS paraugus.

Paraugu prasības ir nelielas, un eksperimentiem var izmantot vismaz 10 kultivētas šūnas.

Liela caurlaidspēja ātrai RNS iegūšanai no kultivētām šūnām, piemēram, 384, 96, 24, 12 un 6 bedrīšu plāksnēm.

DNS Eraser spēj ātri noņemt atbrīvotos genomus, ievērojami samazinot ietekmi uz turpmākajiem eksperimenta rezultātiem.

Optimizētās RT un qPCR sistēmas nodrošina divpakāpju RT-PCR ar efektīvāku reverso transkripciju, specifiskumu un spēcīgāku RT-qPCR reakcijas inhibitora toleranci.

Komplekta pielietojums

Pielietojuma joma: kultivētas šūnas.

Parauga līzes interpretētā RNS: izmantota tikai kā divpakāpju RT-qPCR veidne.

Komplektus var izmantot šādiem mērķiem: gēnu regulējošās ekspresijas analīzei, alēļu pārbaudei, zāļu skrīningam utt.

Komplekta ierobežojumi

Pastiprinātie fragmenti ≤ 300 bp.

Komplektus izmanto svaigu šūnu kultivēšanai.

Produktu kvalitātes kontrole

Saskaņā ar FOREGENE kopējās kvalitātes vadības sistēmu katra Cell Direct RT-qPCR sērijas komplektu partija tiek rūpīgi pārbaudīta vairākas reizes, lai nodrošinātu katras komplektu partijas kvalitātes uzticamību un stabilitāti.

Komplekta saturs

*:Šūnu līze, 5 × Direct RT Mix, 2 × Direct qPCR Mix-Taqman var iegādāties atsevišķi, sīkāka informācija ir sniegta 1. pielikumā (13. lpp.).

Uzglabāšanas apstākļi

1. Piegādes nosacījumi

Viss zemas temperatūras ledus iepakojuma kastes transportēšanas process, lai nodrošinātu, ka komplekts ir <4 °C stāvoklī.

2. Uzglabāšanas apstākļi

Uzglabāt I daļu 4°C un II daļu -20°C.

Foregene Protease Plus II jāuzglabā 4°C temperatūrā, nedrīkst sasaldēt -20°C.

Reaģents 2× Direct qPCR Mix-Taqman tiek uzglabāts -20°C temperatūrā vai 4°C īslaicīgai lietošanai, ja to lieto bieži (10 dienu laikā).

Informācija par komplekta sastāvdaļām

Buferis CL: nodrošina vidi, kas nepieciešama šūnu līzes reakcijām.

Buferis ST: izbeidz aktīvo vielu lizātā, lai izvairītos no ietekmes uz turpmāko RT.

DNS dzēšgumija: DNS noņemšanas līdzeklis, genoma noņemšanas ietekme uz turpmākajiem eksperimentiem.

5× Direct RT Mix: satur augstas RNS afinitātes Foregene reverso transkriptāzi, RNāzes inhibitoru, dNTP, stabilizatorus, pastiprinātājus, optimizētājus un reversās transkripcijas primerus optimālai izlīdzināšanai (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Primer).

Foregene Protease Plus II: līzes bufera kontekstā šūnas tiek lizētas, lai atbrīvotu nukleīnskābes.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: Šis reaģents satur Hot D-Taq DNS polimerāzi, dNTP, MgCl₂, reakcijas buferis, PCR optimizētājs un stabilizators.

20 × ROX atsauces krāsa: parasti izmanto ABI, Stratagene un citu uzņēmumu reāllaika PCR pastiprināšanas instrumentos, to izmanto, lai pielāgotu atšķirību starp PCR caurulēm un caurulēm, ko izraisa PCR dozēšanas kļūdas.Dažādiem instrumentiem nepieciešamā 20× ROX Reference Dye koncentrācija ir atšķirīga, un lietotājs to var pievienot atbilstoši ieteicamajai instrumenta koncentrācijai.

RNāzes nesaturošs ddH₂O: RNāzes nesaturošs sterilizēts īpaši tīrs ūdens divpakāpju RT-qPCR reakcijām.

Piesardzības pasākumi:(Pirms komplekta lietošanas noteikti rūpīgi izlasiet piesardzības pasākumus)

Pievērsiet uzmanību eksperimenta darbības metodei, lai izvairītos no savstarpējas inficēšanās starp paraugiem.

Pievērsiet uzmanību eksperimentālās vides un piederumu tīrībai, lai izvairītos no RNāzes piesārņojuma un RNS degradācijas.

Paņemiet svaigus vai labi konservētus šūnu paraugus un nekad neizmantojiet atkārtotus sasaldētus vai atkausētus šūnu paraugus.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman vajadzētu izvairīties no atkārtotas sasaldēšanas-atkausēšanas, pretējā gadījumā tas ietekmēs reverso transkripciju un PCR efektivitāti.

Prepadevaspirms tamdarbība

Pirms šī komplekta lietošanas noteikti rūpīgi izlasiet instrukcijas.Cell Direct RT-qPCR komplekts ir vienkāršs, ērts un ātri lietojams, un instrukcija sniedz pilnīgu informāciju par visu komplektu un to, kā to pareizi lietot.Pirms lietošanas sagatavojiet nepieciešamos eksperimentālos materiālus un aprīkojumu.

Eksperimentālie materiāli un aprīkojums

◆ Kultūras šūnas.

◆ 1,5 ml vai 2 ml, RNase-/DNase-Free centrifūgas caurule, RNase-/DNase-Free uzgalis, 0,2 ml sterila qPCR caurule.

◆ qPCR iekārta, pipete, galda centrifūga (≥13 400×g) (atkarībā no eksperimentālajām vajadzībām) utt.

Drošība

◆ Šis produkts ir paredzēts tikai zinātniskiem pētījumiem, lūdzu, neizmantojiet to farmācijas, klīniskiem, pārtikas un kosmētiskiem nolūkiem.

◆ Lietojot ķīmiskas vielas, valkājiet piemērotu laboratorijas apģērbu, cimdus, aizsargbrilles utt.

Darbībaceļveži

Šūnu līzes sistēmas, RT sistēmas un qPCR reakcijas šķīduma papildinājumu pakotnes var iegādāties atsevišķi, sīkāku informāciju skatiet 1. pielikumā (13. LAPĀ).

Darbības rokasgrāmata

A: RNS atbrīvošanas paraugs

1. Šūnas tika iepriekš apstrādātas: nomazgājiet šūnu kultūras plati ar aukstu PBS, pēc tam lizējiet šūnas (10-10⁶), 10⁶ nekā šūnu daudzums, RNS ekstrakcijai un attīrīšanai ir ieteicams Foregene the Cell an RNA Isolation Kit the Total (DE-03111) vai Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011).

1.1.Adherent šūnas (24 bedrīšu plāksne kā piemērs)

1.1.1.Nosakiet šūnu skaitu katrā iedobē, nosakiet, ka šūnu skaits ir 1 × 10⁵, un izmantojiet pipeti, lai izņemtu barotni no kultivēšanas trauka.

1.1.2.Katrai iedobei pievieno 200 μl iepriekš atdzesēta 1 × PBS.Nepipetējiet atkārtoti un izņemiet PBS no iedobēm.Nolieciet plāksni un noņemiet pēc iespējas vairāk PBS.Pārejiet uz 2. darbību.

1.1.3.Šūnu mazgāšanai tika pievienota cita šūnu kultūras trauka vai atsauces numuru tabula 1-1 šūnu kultūras traukā, kas iepriekš atdzesēta 1 × PBS.

Tabula 1-1: PBS deva dažādam šūnu skaitam

Piezīme：Lai nodrošinātu stingru pielipšanu šūnām，mazgāšanas laikā tiek novērsts liels šūnu zudumu skaits.

1.2.Suspensijas šūnas vai pielipušās šūnas, kas kultivētas neporainās plāksnēs

1.2.1.Adherentās šūnas, kas kultivētas plāksnēs, kurās nav daudz iedobju (suspensijas šūnas sākas ar nākamo soli 1.2.2.), savāc un atdala šūnas saskaņā ar parasto šūnu savākšanas metodi un ievieto kultivēšanas plāksnē vai centrifūgas mēģenē;ja tiek izmantota tripsinizācija, nepieciešama centrifugēšana, lai savāktu šūnas un noņemtu tripsīna atlikumus, pievieno PBS atkārtoti suspendētas šūnas atsevišķās šūnās, lai šūnas izkliedētu.

1.2.2.Pēc saskaitīto šūnu skaita alikvotās šūnas tika sadalītas 1 × 10⁵ vienu centrifugēšanai mēģenēs, savāc šūnas, centrifugējot ar ātrumu 1000 × g 10 minūtes.

1.2.3.Pievienojiet centrifūgas mēģenei 200 μl PBS, nepipetējiet atkārtoti un tieši aspirējiet PBS.pārejiet uz 2. darbību. (Ja ir grūti nogulsnēt un šūnas tika atkārtoti suspendētas, var veikt 1000 × g centrifugējot 10 minūtes pēc supernatanta izmešanas, šūnu nogulsnes pāriet uz 2. darbību)

2. Šūnu līze: Noņemiet buferšķīdumu CL, kura temperatūra ir līdzsvarota līdz istabas temperatūrai, DNS Eraser un Foregene Protease Plus II, saskaņā ar šādu 1.-2. tabulu sagatavotā līzes sistēma: (Līzes šķīdums ir gatavs lietošanai).

Tabula 1-2: šķelšanās sistēmas sagatavošana (Piezīme: sagatavojot uz ledus)

3. (Piemēram, 24 iedobju plāksne) Katrā iedobē pipeti ievadiet 200 μl šūnu līzes pamatmaisījuma, atkārtoti pūš 5-10 reizes, inkubējiet istabas temperatūrā (20-25 ℃) 5 minūtes.

Piezīme：Lai izvairītos no burbuļu veidošanās, lūdzu, pipetes laikā pipetes skala tika noregulēta uz 200 μl vai mazāk.Pēc līzes šūnas var izskatīties duļķainas, kas ir normāli.

4. (24 iedobju plāksne kā piemērs) tiek pievienota šķidrumā 20 μl buferšķīduma ST (dažādas līzes sistēmas Buferšķīdums ST pievienots 1-3 tabulā norādītajā daudzumā), atkārtoti pipetējot 5-10 reizes, istabas temperatūrā (20-25 ℃) inkubēja 2 minūtes.

Piezīme：Pipetes gals atrodas zem virsmas, nodrošinot lizāta pievienošanu，lai izvairītos no burbuļu veidošanās, lūdzu, pipetes laikā pipetes skala tika noregulēta uz 200 μl vai mazāk.

1-3 tabula：Pievienot buferi ST

5. Lizātu izmanto turpmākajos RT-qPCR eksperimentos.Ja turpmākos eksperimentus nevar veikt laikā, lūdzu, turiet to uz ledus ne ilgāk kā 2 stundas un uzglabājiet -20 ℃ vai -80 ℃ (ne vairāk kā trīs mēnešus).

B: RT sistēmas sagatavošana

1.Izņemiet 5 × Direct RT Mix un novietojiet to uz ledus vannas, ļaujiet tai dabiski izkust un viegli samaisiet vēlākai lietošanai;izņemiet RNase-Free ddH2O un izkausējiet to un novietojiet uz ledus vannas vēlākai lietošanai.Sagatavojiet reakcijas sistēmu uz ledus saskaņā ar 2-1 tabulu zemāk.

Tabula 2-1: RT reakcijas sistēmas sagatavošana

2.Pēc sistēmas formulēšanas pabeigšanas uzmanīgi samaisiet un īsi centrifugējiet tālāk norādītajā tabulā 2 -2 reakcijas apstākļi RT reakcija.

Tabula 2-2: RT Reakcijas stāvokļa iestatījums

3. Pēc reakcijas pabeigšanas reakcijas produkts tika novietots tieši uz ledus qPCR, lūdzu, ievietojiet ilgtermiņa saglabāšanu -20 ℃ vai -80 ℃.

Piezīme. Neattīrītas veidnes izmantošanas dēļ reversās transkripcijas produktā var parādīties baltas nogulsnes.Tā ir normāla parādība.Nekavējoties centrifugējiet supernatantu turpmākajiem eksperimentiem.

Iegūto RT reakcijas šķīdumu pievieno nākamā posma reālā laika PCR reakcijas sistēmām, ieteicams pievienot daudzumus no 10-30% no reakcijas sistēmas.

C: qPCR reakcijas sistēmas sagatavošana

1. Atbilstošs B daudzums, kas sagatavots solī cDNS veidni saskaņā ar nākamo tabulu 3-1, lai sagatavotu reakcijas sistēmu.

Piezīme: cDNS veidnes daudzums veido 10–30% no qPCR sistēmas.Piemēram, 20 μl qPCR sistēmā pievienojiet 2–6 μl līzes buferšķīduma, bet ne vairāk kā 6 μl.

2. Labi qPCR apstākļi (atlaidināšanas temperatūra utt.) qPCR reakcijai (reakcijas apstākļi norādīti 3-2. tabulā).

Piezīme. Lai iegūtu labākus rezultātus, mēģiniet izmantot optimizētus apstākļus qPCR reakcijām.

Tabula 3-1: PCR reakcijas sistēmas sagatavošana

1*: Primera koncentrāciju var regulēt diapazonā no 50 līdz 900 nM, ja praimera reakcija ir slikta.

Piezīme: qPCR sistēmu var pielāgot atbilstoši eksperimentālajām vajadzībām un fluorescences cikla modelim.qPCR 50μl sistēmu, proporcionāli noregulējiet reaģenta devu atbilstoši 20μl sistēma.

2*: atlasiet atbilstošo ROX Reference Dye galīgo koncentrāciju saskaņā ar fluorescences kvantitatīvo termisko ciklu.Vispiemērotākās ROX atsauces krāsas koncentrācijas parastajiem fluorescences kvantitatīviem ciklētājiem ir parādītas tabulā zemāk:

Tabula 3-2: ir sniegti qPCR reakcijas apstākļi

Piezīme. Lai iegūtu vislabāko qPCR efektu, var izmantot gradienta PCR, lai optimizētu reakcijas apstākļus dažādām veidnēm un dažādiem primeriem.PCR reakcijas apstākļi atšķiras atkarībā no fluorescences analizatora, veidnes, primera utt. Konkrētajā darbībā optimālie reakcijas apstākļi ir jāveido atbilstoši fluorescences kvantitatīvā termiskā ciklaatora īpašajiem apstākļiem, šablona veidam, interesējošā fragmenta izmēram, amplificētā fragmenta bāzes secībai un GC saturam un primeru garumam, ieskaitot atkvēlināšanas temperatūru, reakcijas laiku utt.

Reālā laika PCR primer dizaina principi

Forward Primer un Reverse Primer

Reāllaika PCR gadījumā primer dizains ir ļoti svarīgs.Praimeri ir saistīti ar PCR amplifikācijas specifiku un efektivitāti, un tos var veidot, pamatojoties uz šādiem principiem:

◆ Primer garums: 18-30bp.

◆ GC saturs: 40-60%.

◆ Tm vērtība: Primer projektēšanas programmatūra, piemēram, Primer 5, var norādīt gruntskrāsas Tm vērtību.Augšējā un lejtecē esošo primeru Tm vērtībām jābūt pēc iespējas tuvākām.Var izmantot arī Tm aprēķina formulu: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Veicot PCR, par atkausēšanas temperatūru parasti tiek izvēlēta temperatūra, kas ir zemāka par primera Tm vērtību 5 °C (atbilstošs atkausēšanas temperatūras paaugstinājums var palielināt PCR reakcijas specifiku).

◆ Primeri un PCR produkti:

◆ Dizaina primer PCR amplifikācijas produkta garums ir vēlams 100-150 bp.

◆ Pēc iespējas jāizvairās no dizaina gruntēšanas veidnes sekundārajā konstrukcijas zonā.

◆ Izvairieties no 2 vai vairāk komplementāru bāzu veidošanās starp augšpus un lejpus esošajiem primeriem 3′ galiem.

◆ Primer 3′ spailes pamatne nevar būt ar 3 papildu secīgiem G vai C.

◆ Pašiem praimeriem nevar būt komplementāras struktūras, pretējā gadījumā veidosies matadata struktūra, kas ietekmēs PCR amplifikāciju.

◆ Primer secībā ATCG ir jāsadala pēc iespējas vienmērīgāk, un jāizvairās no 3′ gala pamatnes kā T.

Pielikums1：Cell TiešaisRT-qPCR Komplekta sastāvdaļat papildinājumu iepakojums

1. Šūnu līzes šķīdums