1. Sākotnējā izpratne

Šajā posmā mums ir jāsaprot daži jēdzieni un terminoloģija, lai nepieļautu kļūdas mūsu senioru priekšā, piemēram:

J: Kāda ir atšķirība starp RT-PCR, qPCR, reāllaika PCR un reāllaika RT-PCR?

Atbilde: RT-PCR ir reversās transkripcijas PCR(reversās transkripcijas PCR, RT-PCR), kas ir plaši izmantots polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR) variants.RT-PCR RNS virkne tiek reversi transkribēta komplementārā DNS, ko pēc tam izmanto kā veidni DNS amplifikācijai ar PCR.
Reāllaika PCR un qPCR(Kvantitatīvā reāllaika-PCR) ir viena un tā pati lieta, abi ir reāllaika kvantitatīvā PCR, kas nozīmē, ka katram PCR ciklam ir reāllaika datu ieraksti, tāpēc sākuma veidņu skaitu var pielāgot precīzai analīzei.

Lai gan šķiet, ka gan reāllaika PCR (reālā laika fluorescējošā kvantitatīvā PCR), gan reversās transkripcijas PCR (reversās transkripcijas PCR) ir saīsināti kā RT-PCR, starptautiskā konvencija ir šāda: RT-PCR īpaši attiecas uz reverso transkripciju.PCR, reāllaika PCR parasti tiek saīsināts kā qPCR (kvantitatīvā reālā laika PCR).

Un reāllaika RT-PCR (RT-qPCR), tas ir reversās transkripcijas PCR apvienojumā ar fluorescējošu kvantitatīvo tehnoloģiju: vispirms iegūstiet cDNS (RT) no RNS reversās transkripcijas un pēc tam izmantojiet reāllaika PCR kvantitatīvai analīzei (qPCR).Lielākā daļa laboratoriju veic RT-qPCR, tas ir, pētniecību par RNS ekspresijas pazemināšanos, tāpēc qPCR, par kuru visi runā laboratorijā, faktiski attiecas uz RT-qPCR, taču neaizmirstiet, ka klīniskajos lietojumos joprojām ir daudz DNS testu.Kvantitatīvā analīze, piemēram, B hepatīta vīrusa HBV noteikšana.

Jautājums. Kāpēc pēc daudzu fluorescējošu kvantitatīvu PCR nolasīšanas amplificētais fragments jākontrolē diapazonā no 80 līdz 300 bp?

Atbilde: katras gēnu sekvences garums ir atšķirīgs, daži ir vairāki kb, daži simtiem bp, bet mums ir nepieciešams tikai pieprasīt produkta garumam 80-300 bp, izstrādājot primerus, pārāk īss vai pārāk garš nav piemērots fluorescējošai kvantitatīvās PCR noteikšanai.Produkta fragments ir pārāk īss, lai to atšķirtu no primer-dimer.Primer-dimer garums ir aptuveni 30-40 bp, un ir grūti atšķirt, vai tas ir primer-dimer vai produkts, ja tas ir mazāks par 80 bp.Ja produkta fragments ir pārāk garš, pārsniedzot 300 bp, tas viegli novedīs pie zemas amplifikācijas efektivitātes un nevar efektīvi noteikt gēna daudzumu.

Piemēram, kad jūs saskaitāt, cik cilvēku ir klasē, jums tikai jāuzskaita, cik daudz mutes ir.Tas pats attiecas uz gēnu noteikšanu, jums ir jāatrod tikai noteikta gēna secība, lai attēlotu visu secību.Ja grib skaitīt cilvēkus, jāskaita gan mute, gan deguns, gan ausis, gan brilles, un kļūdīties ir viegli.

Lai paplašinātu, bioloģiskajos pētījumos ir daudz pētījumu gadījumu no punkta uz apgabalu, jo jebkuras sugas gēnu secība ir ļoti gara, nav nepieciešams un nav iespējams izmērīt visus fragmentus, piemēram, baktēriju 16S sekvencēšana, kas ir, lai veiktu konservatīvu baktēriju secību Testi, lai secinātu noteiktas baktēriju populācijas skaitu.

J: Kāds ir optimālais garums qPCR primer dizainam?

Atbilde: Vispārīgi runājot, primer garums ir aptuveni 20-24 bp, kas ir labāk.Protams, izstrādājot grunti, mums jāpievērš uzmanība gruntskrāsas TM vērtībai, jo tas ir saistīts ar optimālo atlaidināšanas temperatūru.Pēc daudziem eksperimentiem ir pierādīts, ka 60°C ir labāka TM vērtība.Ja atkausēšanas temperatūra ir pārāk zema, tas viegli novedīs pie nespecifiskas pastiprināšanas.Ja atkausēšanas temperatūra ir pārāk augsta, pastiprināšanas efektivitāte būs salīdzinoši zema, pastiprināšanas līknes maksimums sāksies vēlāk, un CT vērtība tiks aizkavēta.

J: Kā krāsošanas metode atšķiras no zondes metodes?

Atbilde: Krāsu metodeDažas fluorescējošās krāsvielas, piemēram, SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO u.c., pašas par sevi neizstaro gaismu, bet izstaro fluorescenci pēc saistīšanās ar divpavedienu DNS mazāko rievu.Tāpēc PCR reakcijas sākumā iekārta nevar noteikt fluorescējošu signālu.Kad reakcija sasniedz atlaidināšanas-paplašināšanas stadiju, dubultā virkne tiek atvērta, un DNS polimerāzes iedarbībā tiek sintezēta jauna virkne, un fluorescējošā molekula saistās ar dsDNS mazo rievu.Palielinoties PCR ciklu skaitam, arvien vairāk krāsvielu tiek apvienotas ar divpavedienu DNS, un arī fluorescējošais signāls tiek nepārtraukti uzlabots.Krāsošanas metodi galvenokārt izmanto zinātniskajos pētījumos.
PS: Esiet piesardzīgs, veicot eksperimentu, krāsviela ir jāapvieno ar cilvēka DNS, esiet uzmanīgi, lai pārvērstu to par fluorescējošu personu.

Krāsošanas metode (pa kreisi) Zondes metode (pa labi)
PS: Esiet piesardzīgs, veicot eksperimentu, krāsviela ir jāapvieno ar cilvēka DNS, esiet uzmanīgi, lai pārvērstu to par fluorescējošu personu.

SYBR Green Ⅰ saistās ar mazāko DNS rievu

Zondes metodeTaqman zonde ir visbiežāk izmantotā hidrolīzes zonde.Zondes 5′ galā ir fluorescējoša grupa, parasti FAM, un pati zonde ir secība, kas papildina mērķa gēnu.3′ galā ir fluorescējoša dzēšanas grupa.Saskaņā ar fluorescences rezonanses enerģijas pārneses principu (Förster rezonanses enerģijas pārnešana, FRET), kad tiek ierosināta ziņotāja fluorescējošā grupa (donora fluorescējošā molekula) un slāpējošā fluorescējošā grupa (akceptora fluorescējošā molekula) Kad spektri pārklājas un attālums ir ļoti tuvs (7-10 nm) donora fluorescenta akceptētajā molekulā. ule, kamēr autofluorescence ir novājināta.Tāpēc PCR reakcijas sākumā, kad zonde ir brīva un neskarta sistēmā, reportiera fluorescējošā grupa neizstaro fluorescenci.Atkausējot, gruntējums un zonde saistās ar veidni.Pagarināšanas posmā polimerāze nepārtraukti sintezē jaunas ķēdes.DNS polimerāzei ir 5′-3′ eksonukleāzes aktivitāte.Sasniedzot zondi, DNS polimerāze hidrolizēs zondi no veidnes, atdalīs reportiera fluorescējošo grupu no slāpētājas fluorescējošās grupas un atbrīvos fluorescējošu signālu.Tā kā starp zondi un veidni pastāv savstarpēja saistība, zondes metode testa precizitātes un jutīguma ziņā ir pārāka par krāsvielu metodi.Zondes metodi galvenokārt izmanto diagnostikā.

J: Kas ir absolūtā kvantifikācija?Kas ir relatīvā kvantifikācija?

Atbilde: Absolūtā kvantitatīva noteikšana attiecas uz qPCR pārbaudāmā parauga sākotnējās kopijas skaita aprēķinu, piemēram, cik daudz HBV vīrusu ir 1 ml asiņu.Rezultāts, kas iegūts ar relatīvo kvantitatīvo noteikšanu, ir mērķa gēna daudzuma izmaiņas konkrētā paraugā attiecībā pret citu atsauces paraugu, un gēnu ekspresija tiek regulēta uz augšu vai uz leju.

J: Vai RNS ekstrakcijas apjoms, reversās transkripcijas efektivitāte un amplifikācijas efektivitāte ietekmēs eksperimentālos rezultātus?
J: Vai paraugu uzglabāšana, ekstrakcijas reaģenti, reversās transkripcijas reaģenti un gaismu caurlaidīgie palīgmateriāli ietekmēs eksperimentālos rezultātus?
J: Kāda metode var labot eksperimentālos datus?

Attiecībā uz šīm problēmām mēs tās detalizēti aprakstīsim tālāk sniegtajās papildu un papildu sadaļās.
2. Padziļinātas zināšanas

Attiecībā uz reāllaika fluorescējošu kvantitatīvo PCR mums ir jāatzīst realitāte, ka katru gadu tiek publicēti tūkstošiem zinātnisku pētījumu, starp kuriem fluorescējošā kvantitatīvā PCR tehnoloģija nav mazs skaits.

Ja nav vienota standarta fluorescējošā kvantitatīvā PCR eksperimenta mērīšanai, rezultāti var ievērojami atšķirties.Vienam un tam pašam vienas sugas gēnam ar vienu un to pašu apstrādes metodi noteikšanas rezultāti arī ļoti atšķirsies, un novēlotajiem būs grūti atkārtot tos pašus rezultātus.Jūs Neviens nezina, kas ir pareizi un kas nepareizi.

Vai tas nozīmē, ka fluorescējošā kvantitatīvā PCR ir viltus tehnoloģija vai neuzticama tehnoloģija?Nē, tas ir tāpēc, ka fluorescējošā kvantitatīvā PCR ir jutīgāka un precīzāka, un nedaudz nepareiza darbība radīs pilnīgi pretējus rezultātus.Neliels zaudējums ir tūkstoš jūdžu attālumā.Raksta autoru recenzenti var atkārtoti spīdzināt.Tajā pašā laikā žurnāla recenzentus ir grūti izvēlēties arī no dažādiem eksperimentu rezultātiem.

Kopumā norādot uz vienprātības trūkumu reāllaika PCR eksperimentos.Šim nolūkam nozares vecākie zinātnieki sāka formulēt standartus,pieprasīt, lai līdzstrādnieki rakstā sniegtu dažus nepieciešamos eksperimentālos un datu apstrādes datus (tostarp nepieciešamos datus), lai tie atbilstu šiem standartiem .

Recenzenti var spriest par eksperimenta kvalitāti, izlasot šīs detaļas;nākamie lasītāji to var arī izmantot, lai atkārtotu eksperimentu vai uzlabotu eksperimentu.Tad šādi iegūtie eksperimentu rezultāti ir informācijas pilni, kvalitatīvi un lietojami.

MIBBI (minimālā informācija bioloģiskiem un biomedicīniskiem pētījumiem —http://www.mibbi.org) radās.MIBBI ir projekts, kas nodrošina eksperimentu standartus.Tas tiek publicēts dabā.Šis projekts ir vērsts uz dažādiem bioloģiskiem eksperimentiem, tostarp šūnu bioloģiju, Microarray, qPCR, par ko mēs tagad runāsim utt., un paredz katru eksperimenta veidu, iesniedzot manuskriptus.Šī informācija ir jāsniedz vienmēr.

MIBBI projektā ir divi raksti, kas saistīti ar fluorescējošu kvantitatīvo PCR, proti,:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – strukturēta valoda un atskaites ceļvedis reāllaika kvantitatīviem PCR datiem;
·MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) – minimālā informācija, lai publicētu rakstus par reāllaika kvantitatīviem PCR eksperimentiem.
Pirmkārt, parunāsim par RDML, terminoloģijas specifikāciju.

Ja visam nav standarta definīcijas, diskusiju turpināt nav iespējams, tāpēc arī terminu skaidrojums eksāmenā ir tik svarīgs.
Fluorescējošā kvantitatīvā PCR eksperimentā izmantotā terminoloģija ietver šādu saturu.QIAGEN mums ir sagatavojis vislabāko kopsavilkumu.Tālāk visi ir sausipreces .

Pastiprināšanas līkne
Pastiprināšanas līkne attiecas uz līkni, kas izveidota PCR procesa laikā ar cikla numuru kā abscisu un reāllaika fluorescences intensitāti reakcijas laikā kā ordinātu.

Lieliskai pastiprināšanas līknei vajadzētu būt šādām īpašībām: bāzes līnija ir plakana vai nedaudz pazemināta, un nav acīmredzamas augšupejošas tendences;līknes lēciena punkts ir skaidrs, un eksponenciālās fāzes slīpums ir proporcionāls pastiprināšanas efektivitātei.Jo lielāks slīpums, jo augstāka pastiprināšanas efektivitāte;vispārējā pastiprināšanas līkne Paralēlisms ir labs, norādot, ka katras lampas pastiprināšanas efektivitāte ir līdzīga;zemas koncentrācijas paraugu amplifikācijas līknes eksponenciālā fāze ir acīmredzama.

Pamatlīnija (bāzes līnija)
Bāzes līnija ir agrīnā cikla trokšņa līmenis, parasti mēra starp 3. un 15. ciklu, jo amplifikācijas produkta izraisīto fluorescences vērtības pieaugumu šajā periodā nevar noteikt.Bāzes līnijas aprēķināšanai izmantoto ciklu skaits var būt dažāds, un tas var būt jāsamazina, ja tiek izmantoti lieli šablonu daudzumi vai ja mērķa gēna ekspresijas līmenis ir augsts.

Lai iestatītu bāzes līniju, ir jāskatās fluorescences dati no linearitātes pastiprināšanas līknes.Bāzes līnija ir iestatīta tā, lai pastiprināšanas līknes pieaugums sākas ar cikla numuru, kas ir lielāks par bāzes līnijas cikla augšējo skaitli.Bāzes līnijas ir jāiestata atsevišķi katrai mērķa secībai.Vidējās fluorescences vērtības, kas konstatētas agrīnajos ciklos, ir jāatņem no fluorescences vērtībām, kas iegūtas pastiprinātajos produktos.Dažādu reāllaika PCR programmatūras jaunākās versijas ļauj automātiski optimizēt sākotnējos iestatījumus atsevišķiem paraugiem.

Pirmajos dažos PCR amplifikācijas reakcijas ciklos fluorescences signāls daudz nemainās.Tuvošanos taisnai līnijai sauc par bāzes līniju, bet, ja mēs rūpīgi aplūkojam dažus pirmos ciklus, mēs redzam, ka bāzes līnijas ietvaros notiek tas, kas notiek zemāk esošajā attēlā.

Fons Fons attiecas uz
nespecifiskā fluorescences vērtība reakcijā.Piemēram: neefektīva fluorescences dzēšana;vai liels skaits divpavedienu DNS veidņu SYBR Green izmantošanas dēļ.Signāla fona komponentus matemātiski noņem reāllaika PCR programmatūras algoritms.

Reportiera signāls
Reportiera signāls attiecas uz fluorescējošu signālu, ko reāllaika PCR laikā ģenerē SYBR Green vai fluorescējoši marķētas secībai specifiskas zondes.

Normalizēts ziņotāja signāls (RN)
RN attiecas uz reportierkrāsas fluorescences intensitāti, kas dalīta ar pasīvās atsauces krāsas fluorescences intensitāti, kas izmērīta katrā ciklā.

Pasīvā atsauces krāsa
Dažos reāllaika PCRfluorescējošā krāsa ROX tiek izmantota kā iekšēja atsauce fluorescējošā signāla normalizēšanai.Tas koriģē atšķirības, ko izraisa neprecīza pipetēšana, iedobes novietojums un fluorescences svārstības, pamatojoties uz katru iedobi.

Fluorescences slieksnis (slieksnis)
tika noregulēts virs fona vērtības un ievērojami zem amplifikācijas līknes plato vērtības.Tam jāatrodas amplifikācijas līknes lineārajā apgabalā, kas atspoguļo PCR noteikšanas log-lineāro diapazonu.Log-amplifikācijas līknes skatā jāiestata sliekšņi, lai PCR log-lineārā fāze būtu viegli identificējama.Ja reāllaika PCR ir vairāki mērķa gēni, katram mērķim ir jāiestata slieksnis.Parasti pirmo 15 PCR reakcijas ciklu fluorescences signālu izmanto kā fluorescences fona signālu, un fluorescences slieksnis ir 10 reizes lielāks par fluorescences signāla standarta novirzi pirmajos 3 līdz 15 PCR ciklos, un fluorescences slieksnis tiek iestatīts PCR eksponenciālās amplitūdas fāzē.Parasti katram instrumentam pirms lietošanas ir iestatīts fluorescences slieksnis.

Cikla slieksnis (CT) vai šķērsošanas punkts (CP)
Cikls, kurā pastiprināšanas līkne šķērso slieksni (ti, punkts, kurā fluorescences noteikšana ievērojami palielinās).CT var būt daļa, un var aprēķināt sākuma veidnes daudzumu.CT vērtība atspoguļo ciklu skaitu, kad fluorescējošais signāls katrā PCR reakcijas mēģenē sasniedz iestatīto slieksni.Pastāv lineāra sakarība starp katras veidnes CT vērtību un veidnes sākotnējās kopijas numura logaritmu,jo lielāks sākotnējais kopijas numurs, jo mazāka ir CT vērtība un otrādi.Standarta līkni var izveidot, izmantojot standartu ar zināmu sākotnējo kopijas numuru, kur abscisa apzīmē CT vērtību, bet ordināta attēlo sākotnējās kopijas numura logaritmu.Tāpēc, kamēr tiek iegūta nezināmā parauga CT vērtība, parauga sākotnējo kopijas numuru var aprēķināt no standarta līknes.

ΔCT vērtība
ΔCT vērtība aprakstaatšķirība starp mērķa gēnu un atbilstošā endogēnā atsauces gēna CT vērtību, piemēram, mājturības gēns, un tiek izmantots, lai normalizētu izmantotās veidnes daudzumu:
⇒ΔCT = CT (mērķa gēns) – CT (endogēnais atsauces gēns)

ΔΔCT vērtība
ΔΔCT vērtība apraksta atšķirību starp interesējošā parauga (piemēram, stimulētu šūnu) vidējo ΔΔCT vērtību un atsauces parauga (piemēram, nestimulētas šūnas) vidējo ΔΔCT vērtību.Atsauces paraugu sauc arī par kalibrēšanas paraugu, un visi pārējie paraugi tiek normalizēti, lai veiktu relatīvo kvantitatīvo noteikšanu:
⇒ΔΔCT = vidējais ΔCT (interesējošais paraugs) — vidējais ΔCT (references paraugs)

Endogēni atsauces gēni (endogēnie atsauces gēni)
Endogēno atsauces gēnu, piemēram, mājturības gēnu (mājturības gēnu), ekspresijas līmeņi paraugos neatšķiras.Atsauces gēna CT vērtību salīdzināšana ar mērķa gēnu ļauj normalizēt mērķa gēna ekspresijas līmeni atbilstoši ievades RNS vai cDNS daudzumam (skatiet iepriekš sadaļu par ΔCT vērtībām).

Iekšējie atsauces gēni ir pareiziiespējama RNS degradācija vai enzīmu inhibitoru klātbūtne RNS paraugos, kā arī RNS satura variācijas, reversās transkripcijas efektivitāte, nukleīnskābju atgūšana un parauga apstrāde.Lai izvēlētos optimālo(-s) atsauces gēnu(-s), mēs modificējām algoritmu, lai ļautu tai izvēlēties optimālo atsauci atkarībā no eksperimentālā iestatījuma.

Iekšējā kontrole
Kontroles secība, kas tiek pastiprināta tajā pašā reakcijā kā mērķa secība un pārbaudīta ar citu zondi (ti, veicot duplekso PCR).Iekšējās kontroles bieži tiek izmantotas, lai izslēgtu neveiksmīgus pastiprinājumus, piemēram, ja mērķa secība netiek atklāta.
Kalibrēšanas paraugs
Atsauces paraugs (piemēram, attīrīta RNS no šūnu līnijas vai audiem), ko izmanto relatīvā kvantitatīvā noteikšanā, lai salīdzinātu visus pārējos paraugus, lai noteiktu gēna relatīvo ekspresijas līmeni.Kalibrēšanas paraugs var būt jebkurš paraugs, bet parasti tas ir kontrole (piemēram, neapstrādāts paraugs vai paraugs no eksperimenta nulles laika).

Pozitīva kontrole
izmantot kontroles reakcijas arzināms veidnes daudzums.Pozitīvas kontroles bieži tiek izmantotas, lai pārbaudītu, vai gruntēšanas komplekts vai primer-zondes komplekts darbojas pareizi un vai reakcija ir iestatīta pareizi.

Nav veidņu kontroles (NTC)
Kontroles reakcija, kas satur visas nepieciešamās amplifikācijas reakcijas sastāvdaļas, izņemot šablonu, ko parasti aizstāj ar ūdeni.Izmantojot NTC, var atrast reaģenta piesārņojuma vai svešas DNS izraisīto piesārņojumu, tādējādi nodrošinot noteikšanas datu autentiskumu un ticamību.NTC kontroles pastiprināšana norāda uz piesārņojumu.

Nav RT kontroles (NRT)
RNS ekstrakcijas process var saturēt genoma DNS atlikumu, kas ir ārkārtīgi kaitīgs un ir vaininieks, kas ietekmē datu kvalitāti un qPCR dabiskais ienaidnieks, tāpēc, plānojot eksperimentus, tas ir jāveido tā, lai tikai pastiprinātu RNS noteikšanu.Ir divi veidi, viens ir izveidot primerus pāri introniem, otrs ir pilnībā noņemt DNS, kurš ir labāks, un tas tiks apspriests vēlāk.NTR kontrole ir maģisks spogulis DNS piesārņojuma noteikšanai.Ja ir pastiprinājums, tas nozīmē, ka ir piesārņojums.

Standarti
Standarti ir zināmas koncentrācijas vai kopiju skaita paraugi, kurus izmanto, lai izveidotu standarta līkni.Lai nodrošinātu standarta stabilitāti, gēna fragments parasti tiek klonēts plazmīdā un izmantots kā standarts.

Standarta līkne
parasti tiek atšķaidīts vismaz 5 koncentrācijas gradientos ar standarta produktu atbilstoši dubultošanas koeficientam, un CT vērtības un kopijas numura koordinātēs tiek ievilkti 5 punkti, un punkti ir savienoti, veidojot līniju, lai izveidotu standarta līkni.Katrai standarta līknei ir jāpārbauda tās derīgums.Slīpuma vērtība ir no –3,3 līdz –3,8, un katra koncentrācija tiek veikta trīs eksemplāros.Punkti, kas būtiski atšķiras no citiem punktiem, ir jāatmet.Pārbaudāmā parauga CT vērtību ievada standarta līknē, un var aprēķināt pārbaudāmā parauga izteiksmes līmeni.

Pārbaudāmā parauga CT vērtību ievada standarta līknē, un var aprēķināt pārbaudāmā parauga sākotnējo kopijas numuru.

Efektivitāte un slīpums
Standarta līknes slīpums atspoguļo reāllaika PCR efektivitāti.
· Slīpums -3,322 norāda, ka PCR pastiprināšanas efektivitāte ir 1 jeb 100% efektīva un PCR produkta daudzums katrā ciklā dubultojas.
· Slīpums, kas mazāks par –3,322 (piemēram, –3,8), norāda uz PCR efektivitāti
· Slīpums, kas lielāks par –3,322 (piemēram, –3,0), norāda, ka PCR efektivitāte ir lielāka par 100%, kas ir interesanti, kā viens PCR cikls varētu radīt vairāk nekā divas reizes pastiprināto produktu?Šī situācija rodas PCR reakcijas nelineārajā fāzē, tas ir, ir liels daudzums nespecifiskas amplifikācijas.

kušanas līkne
Kad qPCR amplifikācija ir pabeigta, PCR produkts tiek uzkarsēts.Temperatūrai paaugstinoties, divpavedienu pastiprināšanas produkts pakāpeniski izkūst, kā rezultātā samazinās fluorescences intensitāte.Sasniedzot noteiktu temperatūru (Tm), liels daudzums produktu izkusīs.Fluorescence strauji samazinās.Dažādiem PCR produktiem ir dažādas Tm vērtības un dažādas kušanas temperatūras, lai varētu noteikt PCR specifiku.

Kušanas līkne (atvasinātā līkne)
Kušanas līkne ir iegūta, lai izveidotu pīķu karti, kas var intuitīvāk attēlot PCR produktu fragmentu situāciju.Tā kā kušanas temperatūra ir DNS fragmenta Tm vērtība, var spriest par dažiem parametriem, kas ietekmē DNS fragmenta Tm vērtību, piemēram, fragmenta lielumu, GC saturu utt. Vispārīgi runājot, saskaņā ar mūsu primer projektēšanas principiem,pastiprinātā produkta garums ir robežās no 80 līdz 300 bp, tāpēc kušanas temperatūrai jābūt no 80°C līdz 90°C.

Kušanas līknes interpretācija: Ja vienīgais galvenais maksimums parādās starp 80°C-90°C, tas nozīmē, ka fluorescējošā kvantitatīvā PCR ir perfekta;ja galvenais maksimums parādās starp 80°C-90°C un dažādi maksimumi parādās zem 80°C, pamatā tiek ņemts vērā grunts dimērs.Lai to atrisinātu, varat mēģināt palielināt atkausēšanas temperatūru;ja galvenais maksimums parādās no 80°C līdz 90°C, bet dažādais maksimums atkal parādās, kad temperatūra paaugstinās, tad pamatā tiek uzskatīts, ka ir DNS piesārņojums, un DNS ir jānoņem eksperimenta sākumposmā.

Protams, joprojām ir dažas nenormālas situācijas, kuras tālāk tiks izdalītas pa vienai.
3. Padziļinātas zināšanas

Lai veiktu qPCR, man jāsaka MIQE,Minimālā informācijagada publicēšanaiKvantitatīvsReāllaika PCREksperimenti — minimālā informācija, lai publicētu rakstus par reāllaika kvantitatīvo PCReksperimenti.Lai visiem vienkāršotu izpratni, mēs vienkāršosim galveno saturu.

Jūs varat meklēt MIQE oriģināltekstu internetā, un vissvarīgākais ir tas, ka tas nosakadatu kontrolsaraksts, kas jānorāda publicējot rakstu .

Recenzenti var spriest par eksperimenta kvalitāti, izlasot šīs detaļas;nākamie lasītāji to var izmantot arī eksperimenta atkārtošanai vai uzlabošanai.
Ir vērts atzīmēt, ka šajā sarakstā katra saraksta nozīme ir atzīmēta attiecīgi ar E vai D.Ko tas nozīmē?E: būtiska informācija (jāiesniedz);D: vēlama informācija (norādiet pēc iespējas vairāk).

MIQE (1) — eksperimentālais dizains
Daudzi nelieši, kas pabeiguši aizstāvību pēc augstskolas studiju beigšanas, nezinās, kā patstāvīgi izveidot eksperimentu, atvērt klades un darīt to, ko skolotājs liek.Rezultātā eksperimentālais dizains nebija stingrs, un žurnāla redakcija teica, ka viņi gribēja izdomāt šo attēlu un to attēlu, tāpēc viņi to darīja apjukuši.Lūk, kā top švaki!

Tuvāk mājām pirmais eksperimenta princips ir noteikteksperimentālās loģikas stingrība.Vissvarīgākais ir eksperimentālais dizains, un vissvarīgākais eksperimentālajā projektā ir tas, kā iestatīt mērķa paraugu, atsauces paraugu (kontroli) un atkārtojumu skaitu, lai eksperimenta dati būtu atsauces, salīdzināmi un pārliecinoši.

Mērķa paraugsattiecas uz paraugu, kuram pēc noteiktas ārstēšanas ir jānosaka mērķa gēns.Atsauces paraugsir paraugs bez jebkādas apstrādes, ko bioloģijā bieži dēvē par savvaļas tipu.

Eksperimentālie atkārtojumiir ļoti svarīgi.Parasti pārliecinošu atkārtojumu skaitam ir jābūt lielākam par trim.Ir jānošķir, kas ir bioloģiskā replikācija un kas ir tehniskā replikācija.

Bioloģiskie replikāti: Tas pats pārbaudes eksperiments veikts ar dažādiem materiāliem (laiks, augi, partijas, reakcijas plāksnes).

Bioloģiskā dublēšanās
Kā piemēru ņemsim piparu apstrādi ar pesticīdiem.Mēs vēlamies izsmidzināt pesticīdus uz trim ABC augiem, tad trīs ABC augi ir trīs bioloģiski atkārtojumi, un tie ir viens un tas pats pārbaudes eksperiments, kas veikts ar dažādiem materiāliem.Bet kā eksperiments noteikti ir nepieciešama kontrole, lai mēs varētu apsmidzināt vienu no auga A zariem, lai izveidotu A eksperimentālo grupu, nevis miglot pārējos auga A zarus, lai izveidotu kontroles grupu.Dariet to pašu ar B un C.

Tehniskie replikāti (tehniskie replikāti): Tas ir atkārtots eksperiments, kas paredzēts, lai izvairītos no kļūdām, ko izraisa darbība, kas faktiski ir dublikāts caurums, kas iekļauts tajā pašā materiālā.Gan apstrādei, gan kontrolei jābūt ar mērķa gēna un iekšējā atsauces gēna atkārtojumiem (vismaz trīs).

Tehnisks atkārtojums
Kā piemēru atkal ņemiet ar pesticīdiem apstrādātos piparus.Auga A eksperimentālajai grupai mēs izveidojām trīs PCR caurumus ar 1, 2 un 3 attiecīgi tā mērķa gēnam un iekšējam atsauces gēnam, lai pēc noteikšanas iegūtu vidējo.Augu A kontrolei arī grupas tiek apstrādātas tādā pašā veidā.Līdzīgi apstrādājiet B un C augus.Tas ir tehnisks atkārtojums.

Ir vērts to atzīmētTas, kas tiek ievadīts statistikā, ir bioloģiskais atkārtojums, un tehniskais atkārtojums ir pārbaudīt, vai eksperimenta procesā nav nejaušu parādību, lai eksperimenta rezultāti būtu ticami, tas ir, lai izvairītos no kļūdām, ņemot to vidējo, kā mēs bieži sakām.

Negatīvās kontroles — NTC un NRT
NTC (bez veidnes kontrole), kontroli bez veidnes, izmanto, lai pārbaudītu, vai eksperimentālais materiāls ir piesārņots.Parasti ūdeni izmanto kā veidni.Ja ir fluorescējoša reakcija, tas norāda, ka laboratorijā ir noticis nukleīnskābju piesārņojums.

Šos piesārņojumus rada: netīrs ūdens, nekvalificēti reaģenti, kas satur endogēno DNS, grunts piesārņojums, laboratorijas iekārtu piesārņojums, aerosola piesārņojums utt., Ir jāizmanto RNāzes attīrītāji un RNāzes inhibitori.Visgrūtāk ir atrast aerosola piesārņojumu.Iedomājieties, ka jūsu laboratorija ir kā smogs, un gaisā ir suspendētas dažādas nukleīnskābes.

NRT (bez reversās transkriptāzes), kontrole bez reversās transkripcijas, ir nereversā transkribētā RNS kā negatīva kontrole, kas ir gDNS atlikuma kontrole.

Veicot gēnu ekspresiju, RNS daudzums tiek noteikts, nosakot cDNS daudzumu pēc reversās transkripcijas.Ja RNS attīrīšanas laikā ir gDNS atlikums, tas radīs kļūdas eksperimenta rezultātos, jo faktiskie iegūtie rezultāti ir gDNS un cDNS.Agregāta līmenī, ne tikai cDNS, gDNS ir pilnībā jānoņem RNS ekstrakcijas laikā.

MIQE (2) — informācijas paraugs
Tā sauktā informācijas paraugs nozīmē, ka, publicējot rakstu par qPCR, mums ir skaidri jāpaskaidro parauga informācija, kas ir neatņemama raksta sastāvdaļa.Tāpat, apstrādājot paraugus, mums ir jāregulē arī savas darbības, lai nodrošinātu paraugu derīgumu.

Parauga apraksts ir tikai rezultāts, un mums vajadzētu pievērst lielāku uzmanību visa eksperimenta laikā ņemtajiem materiāliem.

Eksperimentālo materiālu izvēle
Asins paraugi – izvēlieties svaigas asinis, ne vairāk kā 4 stundas.Šūnu paraugi – izvēlieties svaigas šūnas enerģiskas augšanas periodā.Dzīvnieku audi — izvēlieties svaigus, enerģiski augošus audus.Augu audi – izvēlieties svaigus, jaunus audus.

Noteikti pamanījāt, ka šajos dažos teikumos ir atslēgas vārds: svaigs .
Iepriekš minētajiem paraugiem labākais, rentablākais un stabilākais komplekts tirgū ir Foregene komplekts, kas var ātri un viegli iegūt to DNS un RNS.

Asins DNS mini komplekts

Šūnu kopējās RNS izolācijas komplekts

Dzīvnieku kopējās RNS izolācijas komplekts

Augu kopējās RNS izolācijas komplekts

Augu kopējā RNS izolācijas komplekts Plus

Augu DNS izolācijas komplekts

Eksperimentālo materiālu uzglabāšana
Vispārīgi runājot, mēs neiesakām uzglabāt paraugus, ja apstākļi to atļauj.Tomēr ir daudzi draugi, kuri nevar veikt eksperimentus uzreiz pēc paraugu ņemšanas, un dažiem pat ir jānes šķidrā slāpekļa tvertnes uz lauku paraugu ņemšanai.

Par šāda veida strādīgu draugu varu teikt tikai to, ka jūs nesaprotat reaģentu palīgmateriālus.Tagad daudzi reaģentu patērējamie uzņēmumi ražo reaģentus, kas var uzglabāt RNS paraugus istabas temperatūrā, un jūs varat izvēlēties tos izmantot.Parastā uzglabāšanas metode ir šķidrā slāpekļa uzglabāšana, izmantojot nelielu šķidrā slāpekļa tvertni, kuru ir viegli pārnēsāt.Pēc parauga nogādāšanas atpakaļ laboratorijā uzglabājiet to -80°C ledusskapī.

Eksperimentos ar RNS ir jāievēro sešu vārdu princips:zema temperatūra, bez fermentiem,unātri .

Zemas temperatūras jēdziens ir viegli saprotams;bez enzīmiem RNāze ir visur pasaulē, kurā mēs dzīvojam (pretējā gadījumā jūs būtu nogalinājis HIV), tāpēc tas, kā izvairīties no RNāzes, veicot eksperimentus, ir ļoti svarīgs jēdziens;ātri,Pasaulē nav neviena Kung Fu, kuru nevarētu salauzt, tikai ātrumu nevar salauzt.

Tāpēc savā ziņā, jo īsāks ekstrakcijas laiks, jo labāks komplekts.KāpēcForegene's komplekts uzsver ātrumu, jo viņi to labi zina.

PS: Dažas meitenes eksperimentus veic ļoti rūpīgi, taču tie nav tik labi kā slam dunk pēc vairāku gadu darba.Viņiem šķiet, ka Dievs ir netaisnīgs, sūdzas par citiem un meklē dzīvību.Patiesībā viņa to nesaprata.Viņš slikti aizsargāja RNS, un slam dunk spēlētājs bija veikls.Veicot eksperimentu, viņš domāja, ka pabeigs slam dunk ar trīs reizes, piecām reizēm un diviem dalījumiem, taču viņš eksperimentu veica labi.

Piezīme: Lēnāka, lielāka RNāzes invāzijas iespēja.Kā apmācīt sevi būt ātram?Nav iespējas, vienkārši trenēties vairāk.

Dažādiem eksperimentiem un dažādiem paraugiem joprojām ir nepieciešams izlasīt vairāk literatūras un izvēlēties atbilstošu apstrādes metodi.Paraugu savākšanas un uzglabāšanas procesā MIQE pieprasa, lai tas būtu skaidri ierakstīts darbā, lai recenzenti varētu pārbaudīt darba uzticamību, kā arī apdullinātajiem jauniešiem ir ērti atkārtot jūsu eksperimentu.

Lai gan bioloģiskie eksperimenti ir sarežģīti, tie ir augstākās klases.Ja neesi uzmanīgs, vari apgāzt pasauli.Piemēram, SARS padarīšana par bioķīmisku krīzi vai hibrīdu rīsu izgatavošana, lai glābtu 1,3 miljardus cilvēku.Zemāk redzamais attēls ir ķīmisks eksperiments, jums vajadzētu saprast, cik lepni esat par savu pētījumu, tikai paskatoties uz viņa penim līdzīgo izskatu.Aizmirsti to, nevajag viņu nomelnot.

MIQE (3) – nukleīnskābju ekstrakcija.
Nukleīnskābes ekstrakcija ir liels notikums, un visi molekulārās bioloģijas eksperimenti sākas ar nukleīnskābju ekstrakciju.Pirmkārt, kopēsim MIQE saturu par nukleīnskābju ekstrakciju.

Skatoties uz šo formu, jūs nevarat palikt uz virsmas.Forma ir dogma.Lai būtu labākais students, jums jājautā, kāpēc.Šīs tabulas būtiskākais saturs ir: TiektiesRNS tīrība, integritāte, konsistence un ekstrakcijas daudzums .

Pirmā daļa noprocess vai instruments ir nukleīnskābes ekstrakcijas posms.Ja ekstrahēšanai izmantojat automātisko nukleīnskābju ekstraktoru (uzlabots, lūdzu, sazinieties ar mani, lai iegādātos), jums jānorāda instrumenta modeļa nosaukums.

Komplekta nosaukums un

kāds komplekts tika izmantots detaļām par izmaiņām, kādi īpaši reaģenti tika pievienoti vai kādas īpašas darbības tika veiktas, skaidri jāpaskaidro, lai citi varētu viegli atkārtot jūsu eksperimentu.

Daži cilvēki, ekstrahējot īpašus paraugus, pievieno dažus īpašus reaģentus, domājot, ka tas ir viņu slepenais ierocis, un nestāsta citiem.Turot to noslēpumā, viņi arī zaudē iespēju padarīt jūsu rakstu spīdīgu.Neesi gudrs, zinātniskajos pētījumos jābūt godīgākam par lauku veco Džanu, ja gribi būt gudrs, raksts padarīs stulbu.

jāatceras komplekta produkta numurskad pasūtāt komplektu un uzrakstāt rakstu .Uz komplekta parasti ir divi cipari: Cat — kataloga numurs (produkta numurs, izstrādājuma numurs), partija — produkta partijas numurs (izmanto, lai norādītu, no kuras partijas produkts nāk).

Turklāt CAS numurs bieži tiek izmantots, pasūtot bioķīmiskos reaģentus, un es to kopā popularizēšu.CAS numurs ir Amerikas Ķīmijas biedrības piešķirtais numurs katrai jaunajai ķīmiskajai vielai.Parasti trīs skaitļus savieno ar domuzīmi.Rushui CAS numurs: 7732-18-5.Ķimikālijām bieži ir vairāki aizstājvārdi, taču CAS numurs ir unikāls.Pasūtot zāles, vispirms varat pārbaudīt to CAS numuru.

Tuvāk mājām, kāpēc mums šīs lietas ir skaidri jāapraksta?Faktiski tas ir arī RNS ekstrakcijas kvalitātes pārbaude.Instrumentu un komplektu izmantošana padarīs RNS ekstrakciju konsekventāku.Parasto laboratoriju ekstrakcijas mērogs nav liels, un to var iegūt ar komplektiem.

Sīkāka informācija par DNāzes vai RNāzes ārstēšanu
Svarīgs fluorescējošās kvantitatīvās PCR jautājums ir novērst DNS piesārņojumu un neeksperimentēt, ja ir piesārņojums.Tāpēc ir obligāti jānorāda process, ko izmantojāt DNS apstrādei, lai pierādītu, ka DNS eksperimentālajā procesā ir pilnībā un pilnībā noņemta.attēlots ar shematisku diagrammu.

RNS un DNS shematiska diagramma
Parasti DNS noņemšanas metode ir RNS apstrāde ar DNāzi pēc ekstrakcijas.Tomēr šīs ir salīdzinoši vecas metodes.Komerciālie RNS ekstrakcijas komplekti ir spējuši noņemt DNS ekstrakcijas procesa laikā, nepievienojot DNāzi.Piemēram, komplektu sērija no Foregene .

Piezīme: DNS noņemšana RNS ekstrakcijas laikā ir ļoti bīstams abpusgriezīgs zobens, kas pagarinās RNS ekstrakcijas darbības laiku un palielinās RNS degradācijas risku.Būtībā tas ir kompromiss starp RNS iznākumu un tīrību.

Turklāt silīcija dioksīda adsorbcijas kolonnai pievienotās DNāzes daudzums ir ļoti mazs, un, lai panāktu efektu, ir jāizmanto augstas kvalitātes DNāze.Neoptimizētu DNāzi nevar ātri un pilnībā sagremot.Šī ir tirgotāja tehniskā līmeņa pārbaude.Protams, ir vēl dīvaināki tirgotāji, kuri lepojas, ka DNS var noņemt bez DNāzes.Var teikt, ka ikviens, kurš lepojas, ka DNS var pilnībā noņemt bez DNāzes, ir huligāns.DNS ir samērā stabila divpavedienu struktūra, un to nevar iznīcināt, tikai runājot un smejoties.

Piesārņojuma novērtējums
novērtēšanas metode: elektroforēzes noteikšana, 1% agaroze, 6V/cm, 15min, slodze 1-3 ul

Nukleīnskābju kvantitatīvā analīze
parasti mēra, izmantojot UV spektrofotometru.Vispirms ļaujiet man popularizēt trīs vērtību OD260, OD280 un OD230 nozīmi.
·OD260nm: tas ir nukleīnskābes augstākās absorbcijas maksimuma absorbcijas viļņa garums, un vislabākā izmērītā vērtība ir robežās no 0,1 līdz 1,0.Ja nē, atšķaidiet vai koncentrējiet paraugu, lai tas atbilstu diapazonam.
·OD280nm: tas ir olbaltumvielu un fenola vielu augstākās absorbcijas maksimuma absorbcijas viļņa garums.
·OD230nm: tas ir ogļhidrātu augstākās absorbcijas maksimuma absorbcijas viļņa garums.

Tālāk parunāsim par katra rādītāja lomu.Attiecībā uz A260 to var izmantot, lai izmērītu nukleīnskābes iznākumu.Ja OD260=1, dsDNS=50μg/ml, ssDNS=37μg/ml, RNS=40μg/ml.

Tīrības labad mums ir jāaplūko attiecības, kuras mēs parasti redzam: OD260/280 un OD260/230.
·Tīra DNS: OD260/280 ir aptuveni vienāds ar 1,8.Ja tas ir lielāks par 1,9, tas norāda uz RNS piesārņojumu, un, ja tas ir mazāks par 1,6, tas norāda uz olbaltumvielu un fenola piesārņojumu.
· Tīra RNS: 1.7
·OD260/230: neatkarīgi no tā, vai tā ir DNS vai RNS, atsauces vērtība ir 2,5.Ja tas ir mazāks par 2,0, tas norāda uz cukura, sāls un organisko vielu piesārņojumu.

RNS integritāte

Ir ļoti svarīgi izmērīt RNS integritāti.Parasti ir nepieciešams veikt RNS denaturācijas gēla eksperimentu, lai pārbaudītu, vai spilgtums starp 28S un 18S RNS ir divkāršs.Kad parādās trešā josla 5S, tas nozīmē, ka RNS ir sākusi noārdīties, izņemot bezmugurkaulniekus.

Dati RNS kvalitātes novērtēšanai: Papildus iepriekšminētajiem testiem ir arī daži sarežģītāki instrumentālie testi RNS integritātes ziņā, piemēram, Experion automātiskās elektroforēzes sistēmas RQI integritātes tests, kas var noteikt, vai RNS nav degradēta nemanāmi.

Zinātniskajos pētījumos fluorescējošā kvantitatīvā PCR ir mērķa gēna un iekšējā atsauces gēna salīdzinājums.Tāpēc RNS parauga saglabāšanas, RNS ekstrakcijas utt. procesā galvenais mērķis ir nodrošināt RNS integritāti.

Kā RNS integritāte ietekmē līdzsvaru starp mērķa gēnu un iekšējo atsauces gēnu, var viegli saprast no zemāk esošā attēla.Degradācija novedīs pie gēnu nepilnības, neatkarīgi no tā, vai tā ir iekšējā atsauces gēna nepilnība vai mērķa gēna nepilnība, tam būs liela ietekme uz datiem.

Mērķa gēna un atsauces gēna shematiskā diagramma nedrīkst būt patiesa

Inhibīcijas tests (vai CT vērtība tiek nomākta augstā vai zemā koncentrācijā vai citos apstākļos)

Ņemot šo skaitli kā piemēru, piecu līkņu Ct vērtības ir šādas.CT vērtību sadalījums starp līknēm ir nevienmērīgs, un augstās un zemās koncentrācijās Ct vērtības tiek aizkavētas, kas ir PCR inhibīcijas gadījumā.

Galvenais punkts: RNS ekstrakcijas procesā mums ir jāatsakās no maldīgiem priekšstatiem un jāizveido pareizi.

Nepareiza ideja ir: RNS ekstrakcija tikai nodrošina ražu, domājot, ka jo lielāks iegūtās RNS daudzums, jo labāk.Faktiski, veicot kvantitatīvo noteikšanu, ja gēnu skaits nav ļoti liels, mums nav nepieciešams daudz RNS.Jūsu ekstrahētās RNS daudzums ir vairāk nekā pietiekams.

Pareizā koncepcija ir:RNS ekstrakcijai jātiecas pēc tīrības, integritātes un konsekvences.Tīrība var nodrošināt, ka turpmākā reversā transkripcija netiek kavēta un datus neietekmēs DNS.Integritāte nodrošina mērķa secību un iekšējo atsauču līdzsvaru.Konsistence nodrošina stabilu parauga ielādi.

MIQE (4) – reversā transkripcija
Nepareizs priekšstats: tiekšanās pēc lielāka parauga apjoma.
Pareiza koncepcija: tiecieties pēc konsekvences (stabilitātes), neatkarīgi no ielādētās RNS daudzuma, reversās transkripcijas efektivitāte paliek nemainīga, nodrošinot, ka atšķirības cDNS var patiesi atspoguļot atšķirības mRNS.
Mēs izskaidrojam šo procesu ar shematisku diagrammu:

Apgrieztās transkripcijas efektivitātes shematiskā diagramma nav patiesa
Pirmkārt, mums ir jāsaprot atšķirība starp reversās transkripcijas procesu un PCR procesu.PCR tiek pakļauts vairākiem karsēšanas un atkausēšanas procesiem, un mērķa fragments aug eksponenciāli;lai gan reversajai transkripcijai nav šī procesa, mēs varam iedomāties, ka reversā transkripcija faktiski ir viens pret vienu Replikācijas procesa laikā tik daudz RNS gabalu

cik ir var iegūt tik daudz cDNS informācijas gabalu, tas tagad ir jāsaprot, jo lieli un mazi fragmenti ir reversi transkribēti, un nav iespējams koncentrēties uz vienu fragmentu.Un, tā kā RNS daudzums ir salīdzinoši neliels, arī iegūtais cDNS daudzums ir salīdzinoši neliels, atšķirībā no PCR, kam ir amplifikācijas efekts, tāpēc to būtībā nav iespējams noteikt.

cDNS elektroforēzes rezultāti
Otrkārt, ideālā gadījumā reversā transkripcija tiek veikta viens pret vienu, taču neviena uzņēmuma reversā transkriptāze nevar sasniegt šo efektu.Būtībā lielākās daļas reverso transkriptāžu efektivitāte svārstās no 30 līdz 50%.Ja tas tā ir, mēs drīzāk vēlētos salīdzinoši stabilu reversās transkripcijas efektivitāti, ko mēs vēlamies redzēt attēlā: 3 RNS saņem 2 cDNS, 6 RNS iegūst 4 cDNS, tāpēc neatkarīgi no tā, cik daudz parauga ir ielādēts, reversās transkripcijas efektivitāte ir salīdzinoši stabila.Mēs nevēlamies redzēt situāciju, kad reversās transkripcijas efektivitāte ir nestabila un tiek kavēta augsta koncentrācija.

Tātad, kā pārbaudīt, vai reversās transkripcijas efektivitāte ir stabila?Metode ir ļoti vienkārša, jums ir jāveic tikai salīdzināšanas tests: viens ir veikt reverso transkripciju cDNS pēc RNS divkāršas atšķaidīšanas, otrs ir veikt dubulto atšķaidīšanu pēc reversās transkribēšanas cDNS, un pēc tam veikt qPCR, lai redzētu iegūto slīpumu. Vai tas ir konsekvents.Jums kā izcilam studentam tas būtu jāsaprot dažu sekunžu laikā.Kā parādīts zemāk:

RNS un cDNS atšķaidīšana, lai pārbaudītu, vai reversās transkripcijas efektivitāte ir stabila
Reversā transkriptāze un komplekts
Kā perfektai fluorescējošai kvantitatīvai PCR var būt lieliska reversā transkriptāze un komplekts.Reversā transkriptāze ir aptuveni sadalīta divos veidos atkarībā no avota, AMV vaiM-MLV, un to veiktspēja ir tāda pati, kā parādīts tabulā.

RNāzes H aktivitāte
RNāze H ir ribonukleāze H, ķīniešu nosaukums ir ribonukleāze H, kas ir endoribonukleāze, kas var specifiski hidrolizēt RNS DNS-RNS hibrīda ķēdē.RNāze H nevar hidrolizēt fosfodiestera saites vienpavedienu vai divpavedienu DNS vai RNS, tas ir, tā nevar sagremot vienpavedienu vai divpavedienu DNS vai RNS.Parasti izmanto cDNS otrās daļas sintēzē.

Tā ir dīvaina lieta.Mēs sakām, ka reversajai transkriptāzei ir RNāzes H aktivitāte, nevis to, ka reversā transkriptāze satur RNāzi H, un var nebūt iespējams atdalīt RNāzi H no reversās transkriptāzes, iespējams, dažu grupu konformācijas dēļ reversajā transkriptāzē. Šo aktivitāti izraisa reversā transkriptāze.

Tāpēc, neatkarīgi no AMV augstākās reversās transkripcijas efektivitātes, tā RNāzes H aktivitāte samazina cDNS iznākumu.Protams, reaģentu ražotāji pastāvīgi optimizē savus produktus, lai pēc iespējas vairāk novērstu RNāzes H aktivitāti reversajā transkriptāzē, lai palielinātu cDNS iznākumu.
Atkausēšanas temperatūra

RNS sekundārā struktūra dažādās temperatūrās
Skatiet iepriekš redzamo attēlu RNS sekundārajai struktūrai dažādās temperatūrās un izmantojiet tiešsaistes rīku mFold, lai noteiktu mērķa fragmenta sekundāro struktūru īpašos temperatūras un sāls koncentrācijas apstākļos.55 ° C temperatūrā RNS sekundārā struktūra joprojām ir ļoti sarežģīta, reversā transkriptāze nevar darboties, un sekundāro struktūru nevar pilnībā atrisināt līdz 65 ° C, savukārt AMV un M-MLV optimālā temperatūra ir daudz zemāka par šo temperatūru.
ko darīt?Sekundārā struktūra ir pašas veidnes papildu savienošana pārī, kas izraisa spēcīgu konkurenci starp praimeru un reverso transkriptāzi un veidni, kā rezultātā rodas virkne problēmu, piemēram, zems E un slikta atkārtojamība.

ko darīt?Atlaidināšanas temperatūru palieliniet tikai pēc iespējas vairāk.

Daudzi reaģentu ražotāji uzlabo savu reverso transkriptāzi, izmantojot gēnu inženieriju.Daži palielina reakcijas temperatūru, piemēram, Jifan un Aidelai, un daži noņem aktīvo RNāzes H enzīma grupu, lai uzlabotu afinitāti starp fermentu un RNS veidni.Augsta afinitāte var konkurētspējīgi izspiest sekundāro struktūru un vienmērīgi nolasīt, kā arī ievērojami uzlabot reversās transkripcijas efektivitāti.
Galvenais punkts: Reversā transkripcija ir svarīgāka, lai panāktu reversās transkripcijas efektivitātes konsekvenci (enzīmiem jābūt ne tikai efektīviem, bet arī stabiliem), nevis ielādētā parauga daudzumam, ja tā nav īpaši liela mēroga fluorescējoša kvantitatīvā PCR, tā vispār nebūs iespējama.Vairākas cDNS.
Arī dažādi ražotāji ir pielikuši pūles, lai panāktu konsekvenci.Piemēram, lielākā daļa uzņēmumu tagad ir iesaiņojuši reverso transkripciju kā standarta komplektu pārdošanai, kas ir laba izvēle.
Piemēram, Foregene RT Easy Series komplekti:

RT Easy I (galvenais premikss pirmās daļas cDNS sintēzes komplektam)

MIQE (5) – mērķa gēnu informācija

Iepriekš redzamais attēls izskaidro
1. To, vai šis gēns ir efektīvs atkārtotiem eksperimentiem, parasti var pārbaudīt, veicot atkārtotus eksperimentus.
2. Gēnu ID, jūs zināt.
3. Gēnu garums, mērķa gēna kopējais garums noteikti nav problēma.Veidojot primerus, pārliecinieties, ka amplikona garums ir no 80 līdz 200 bp, lai nodrošinātu labāku pastiprināšanas efektivitāti.
4. Sequence Blast salīdzināšanas informācija, mērķa gēns ir jāsalīdzina gēnu bankā, lai novērstu nespecifisku amplifikāciju.
5. Pseidogēnu klātbūtne.Pseidogēns ir DNS secība, kas līdzīga normālam gēnam, bet zaudē savu normālo funkciju.Tas bieži pastāv vairāku gēnu eikariotu ģimenē.To parasti apzīmē ar ψ.Tā ir nefunkcionāla genoma DNS kopija genomā, kas ir ļoti līdzīga kodējošajai gēnu secībai., parasti netiek transkribēti, un tiem nav skaidras fizioloģiskas nozīmes.
6. Primeru novietojums attiecībā pret eksoniem un introniem.Pirmajos gados, kad mēs atrisinājām DNS piesārņojuma problēmu, mēs bieži pievērsām uzmanību primeru, eksonu un intronu pozīcijām un parasti apsvērām primeru projektēšanu pāri introniem, lai izvairītos no DNS amplifikācijas.Lūdzu, skatiet attēlu zemāk: melns apzīmē intronus, dažādi zilie apzīmē eksonus, rozā apzīmē parastos primerus un spilgti sarkanie apzīmē intronus aptverošus primerus.

Shematiski, nekad nav taisnība
Tas šķiet ideāls plāns, bet patiesībā vairumā gadījumu trans-intronu primeri nav tik maģiski, kā iedomāties, un tie arī izraisīs nespecifisku pastiprināšanos.Tāpēc labākais veids, kā novērst DNS piesārņojumu, ir pilnībā noņemt DNS.
7. Konformācijas prognozēšana.Izmantojot šo piemēru vēlreiz, izmantojiet tiešsaistes rīku mFold, lai noteiktu mērķa fragmenta sekundāro struktūru noteiktā temperatūrā un sāls koncentrācijā.

RNS sekundārā struktūra dažādās temperatūrās
Sekundārā struktūra ir pašas veidnes komplementāra savienošana pārī, kas izraisīs spēcīgu konkurenci starp primeru un veidnes savienošanu, un primer saistīšanās iespēja ir mazāka, kā rezultātā rodas vairākas problēmas, piemēram, zems E un slikta atkārtojamība.Izmantojot programmatūras prognozēšanu, ja nav sekundārās struktūras problēmas, tas būtu lieliski.Ja ir, mūsu turpmākajā rakstā tiks īpaši apspriests, kā atrisināt šo problēmu.

MIQE (6) — qPCR oligonukleotīdi

Fluorescējošai kvantitatīvai PCR pirmā lieta, ar kuru jūs katru dienu cīnāties, ir RNS ekstrakcija, un otrā lieta var būt primer dizains.
Pirmkārt, mēs joprojām pārbaudām noteikumus par gruntējuma dizainu saskaņā ar MIQE kontrolsarakstu.Tas ir tik vienkārši, ka nelieši var pasmieties, un mēs to varam pabeigt vienā teikumā: noskaidrojiet gruntēšanas zondes secību un novietojumu un modifikācijas metodi.Primeru attīrīšanas metodei primeru sintēze pašlaik ir tik lēta, qPCR ir PAGE un augstāku attīrīšanas metožu cienīgs, un sintēzes instrumenta informācija nav svarīga.Daudzi cilvēki jau vairākus gadu desmitus ir darījuši primerus un nezina, ka sintezators ir ABI3900.
Kas attiecas uz gruntskrāsu noformēšanas principiem, tie nav jāiegaumē no galvas, jo šīs problēmas var atrisināt lielākā daļa gruntskrāsu projektēšanas programmatūras vai tiešsaistes rīku (ieteicams tiešsaistes rīks primer3.ut.ee/), un 99,999% gruntskrāsu dizains netiek veikts manuāli.
Vienkārši pārbaudiet šādus punktus pēc gruntskrāsu projektēšanas:
1. Projektēt primerus tuvu 3′ galam: ja cDNS pirmās virknes sintēzei izmanto oligo dT praimerus, ņemot vērā reversās transkripcijas efektivitāti un RNS integritāti, izstrādātie praimeri ir jāprojektē tuvu 3′ galam, lai uzlabotu amplifikācijas efektivitāti.Izmantojiet attēlu, lai paskaidrotu šādi (to nevar saprast):

Kāpēc gruntskrāsas jāprojektē tuvu 3′ galam, tā nedrīkst būt taisnība
2. TM vērtība: Tm vērtība ir 55-65°C (jo eksonukleāzes aktivitāte ir visaugstākā pie 60°C), un GC saturs ir 40%-60%.
3. BLAST: lai izvairītos no nespecifiskas genoma amplifikācijas, papildu pārbaudei jāizmanto Blast.

MIQE(7) — qPCR process

1. qPCR komplekts
Saskaņā ar MIQE prasībām rakstā mums ir skaidri jāapraksta visi reakcijas apstākļi, tostarp PCR reakcijas sistēmas konfigurācija, kāds komplekts tiek izmantots, kas ir ražotājs, cik liela ir reakcijas sistēma, vai tiek izmantota krāsošanas metode vai zondes metode, PCR programmas iestatījumi.Autovadītāji veterāni noteikti atklās, ka, kamēr komplekts ir izvēlēts, iepriekš minētā informācija pamatā ir noteikta.
Pašlaik fluorescējošu kvantitatīvo PCR komplektu ražošana un ražošana ir ļoti nobriedusi tehnoloģija.Kamēr neizvēlaties ārkārtīgi sliktus ražotājus, problēmu iespējamība nav liela, taču mēs tomēr vēlamies ar jums padalīties ar dažiem punktiem:
Karstās palaišanas Taq enzīms:Vissvarīgākā PCR daļa ir karstās palaišanas Taq enzīms.Tirgū esošie karstās palaišanas enzīmi parasti tiek iedalīti divos veidos: viens ir ķīmiski modificēts karstās palaišanas enzīms (varat to iedomāties kā parafīna iegulšanu), bet otrs ir karstās palaišanas enzīms antivielu modificēšanai (antigēna un antivielu saistīšanās).Ķīmiskā modifikācija ir agrīns fermentu karstās palaišanas veids.Kad tiek sasniegta noteikta temperatūra, ferments atbrīvos savu darbību.Ar antivielām modificētais karstās palaišanas enzīms izmanto bioloģiskas metodes, lai bloķētu fermenta aktivitāti.Kad tiek sasniegta noteikta temperatūra, antiviela tiks denaturēta un inaktivēta kā olbaltumviela, un enzīma darbība tiks iesaistīta.

Tomēr kāds no tā labums?Tā tas ir, antivielu modificēto enzīmu izdalīšanās aktivitāte ir ātrāka nekā ķīmiski modificētiem enzīmiem, tāpēc jutības ziņā ar antivielām modificētiem enzīmiem ir neliela priekšrocība, tā ka tirgū esošajos komplektos ķīmiski modificētu enzīmu pamatā nav.Ja ir, tad šī ražotāja tehnoloģija joprojām ir iestrēgusi tūkstošgades laikmetā.
Magnija jonu koncentrācija:Magnija jonu koncentrācija ir ļoti svarīga PCR reakcijā.Atbilstoša magnija jonu koncentrācija var veicināt Taq enzīma aktivitātes izdalīšanos.Ja koncentrācija ir pārāk zema, fermentu aktivitāte ievērojami samazināsies;ja koncentrācija ir pārāk augsta, enzīmu katalizētā nespecifiskā amplifikācija tiks pastiprināta.Magnija jonu koncentrācija ietekmēs arī primeru atkausēšanu, veidnes un PCR produktu kušanas temperatūru, tādējādi ietekmējot pastiprināto fragmentu iznākumu.Magnija jonu koncentrācija parasti tiek kontrolēta pie 25 mM.Protams, labam komplektam magnija jonu koncentrācija ir labi jākontrolē.Daži tirgotāji reaģentam pievieno magnija jonu helātu veidojošo līdzekli, kas var panākt magnija jonu koncentrācijas automātiskas pielāgošanas efektu.
Fluorescējošās krāsas koncentrācija:Fluorescējošā krāsviela, kas ir SYBR Green, ko mēs parasti lietojam, galvenokārt ģenerē fluorescenci, saistoties ar divpavedienu DNS mazāko rievu, jo krāsas saistīšanās ar divpavedienu DNS ir nespecifiska, proti, kamēr ar to tiek apvienota divpavedienu DNS, var rasties fluorescence, un sistēmas fonā tiks izveidoti primer-dimēri.
PS. Pateicoties gaismas jutīgajām īpašībām, tirgū esošie produkti parasti tiek iepakoti brūnās necaurspīdīgās centrifūgas mēģenēs (kā parādīts attēlā zemāk).Tomēr tas radīs problēmu.Paraugu ņemšanas laikā ir grūti redzēt, vai šķidrums ir iesūkts.Šajā ziņā Qingke patiešām ir lietotājam draudzīgākais (kā parādīts attēlā zemāk), un caurspīdīgā caurule ir iepakota necaurspīdīgā skārda maisiņā.Pēc tam ievietojiet to skārda maisiņā, ņemot vērā ērtību izvairīties no gaismas un paraugu ņemšanas.Jums jāizvēlas pareizais produkta numurs.TSE204 ir ļoti rentabla eksistence, kas liek man vēlēties stādīt zāli.

Ļoti svarīga ir arī fluorescējošās krāsas koncentrācija.Ja koncentrācija ir pārāk zema, pastiprināšanas līkne vēlāk nepalielināsies un nav perfekta;ja koncentrācija ir pārāk augsta, tas radīs trokšņa traucējumus.Tā kā fluorescējošā kvantitatīvā PCR galvenokārt ir atkarīga no CT vērtības, ja fluorescējošās krāsas koncentrācija nav pareizi noregulēta, zemākais punkts ir labāks par augstāko punktu.Protams, vislabākā ir piemērota krāsvielas koncentrācija.

ROX: ROX krāsvielas tiek izmantotas, lai labotu fluorescences signāla kļūdas.Daži instrumentu ražotāji pieprasa kalibrēšanu, bet citi to nedara.Piemēram, lai izmantotu Thermo Fisher Scientific reāllaika PCR pastiprināšanas instrumentu, parasti ir nepieciešama kalibrēšana, tostarp 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus utt. Vispārīgajos komplekta norādījumos tas tiks aprakstīts.
Foregene qPCR Mix satur arī ROX krāsvielu, kas ir ērta lietošanai dažādos modeļos.

Reālā laika PCR komplekts-Taqman

Vājas ūdeņraža saites apstrāde: Vāju ūdeņraža saišu apstrāde ir samērā tehnisks jautājums.Nekas nav lasījis daudzu komplektu rokasgrāmatas, taču nevienā no tām šī tēma nav minēta.Patiesībā tas ir tik svarīgi.Bāzu kombinācija galvenokārt ir atkarīga no ūdeņraža saišu stiprības.Spēcīgas ūdeņraža saites ir normāla pastiprināšana, un vājas ūdeņraža saites izraisa nespecifisku pastiprināšanos.Ja vājās ūdeņraža saites nevar labi novērst, nevar izvairīties no nespecifiskas pastiprināšanas.Autora ietvaros šo problēmu ir pamanījuši tikai daži uzņēmumi.Pērkot komplektu, varat atsaukties uz to, vai šajā sakarā esat apsvēris risinājumu komplektam, kuru vēlaties izvēlēties.

Reakcijas apjoms: 20-50ul sistēma tiek izmantota biežāk, un mazāki apjomi var izraisīt kļūdas.Vispārīgi runājot, komplekta instrukcijās ir ieteikts izmantot PCR reakcijas tilpumus.Neesiet gudri un izmantojiet mazākus apjomus, lai ietaupītu izmaksas.mērķis.Tirgotāju ieteiktais apjoms tiešām ir pārbaudīts, un var gadīties, ka viņi nevar atrisināt mazo apjomu radīto kļūdu problēmu.
2. Caurules plāksnes ražotājs un izstrādājuma numurs
Ikviens zina fluorescējošās kvantitatīvās PCR principu.Fluorescences savākšana galvenokārt tiek veikta, izmantojot PCR caurules vāciņus.Izvēloties PCR palīgmateriālus, pievērsiet uzmanību diviem punktiem: laba gaismas caurlaidība un piemērota instrumentam.Vispārīgi runājot, galveno zīmolu dēļi un caurules ir labi, taču jums ir rūpīgi jāizvēlas pielāgošanas ziņā, pretējā gadījumā jūs nevarēsit izmantot instrumentu.

4. Augstākā līmeņa zināšanas

MIQE (8) — qPCR validācija
Tā ir qPCR galvenā prioritāte!Tik daudz varoņu te ir iekrituši smiltīs.Protams, ir arī iespējams, ka jums ir paveicies un pētītie gēni ir vienkārši, tāpēc jūs peldējāt pa ledus alu pa vēju.qPCR verifikācijas informācija ir paredzēta, lai pārbaudītu datu ticamību.Mēs uzskaitām nepieciešamo verifikācijas informāciju šādi:

1. Specifiskuma pārbaude
Mērķgēna amplifikācijas specifiku pārbauda, ​​pārbaudot, vai elektroforēzes attēls ir viena josla;secības pārbaude;kušanas līkne, lai redzētu, vai pīķu karte ir viena;fermentu gremošanas pārbaude un citas metodes.
Šeit mēs koncentrējamies uz tnespecifiskās amplifikācijas analīze, izmantojot kušanas līkņu metodi.Vispārīgi runājot, kad mēs izstrādājam primerus, produkta fragmenta izmēram ir jābūt diapazonā no 80 līdz 200 bp, kas padara PCR produkta kušanas temperatūru diapazonā no 80 līdz 85 °C.Tāpēc, ja ir dažādi pīķi, ir jābūt citiem nespecifiskiem pastiprināšanas produktiem;ja maksimums parādās zem 80°C, to parasti uzskata par grunts dimēru;ja maksimums parādās virs 85°C, tas parasti tiek uzskatīts par DNS piesārņojumu vai lielāku lielu fragmentu nespecifisku pastiprināšanos.
Piezīme. Dažkārt 80°C ir tikai viens maksimums.Šobrīd šī koncepcija ir jāievēro.Iespējams, ka visi amplifikācijas rezultāti ir primer dimēri.

Normāla kušanas līkne (viena pīķa bez nespecifiskas pastiprināšanas)

Problemātiska kušanas līkne (nespecifiska viltotu pīķu pastiprināšana)
【Gadījuma analīze】

Ir galvenais maksimums, bet grunts dimers ir nopietns
Viena pīķa kušanas līkne zemāk esošajā attēlā var viegli maldināt jūsu acis, domājot, ka tas ir ideāls eksperiments, taču rezultāts ir pilnīgi nepareizs.Šajā laikā mums ir jāskatās uz kušanas temperatūru.Maksimālā temperatūra ir zem 80°C, kas ir pilnībā grunts-dimērs.

Nav mērķa fragmenta, visi primer dimēri
Lūk, mans brālis nevar apstāties.Zemāk redzamā bilde ir fotogrāfija, kas uzņemta ar mobilo telefonu, kuru man atsūtījis kāds nelieši.Visi viņa izmantotie reaģenti ir nozarē plaši izmantoti zīmoli.Viņš mainīja vienu T-prefiksa zīmolu uz citu T-prefiksa zīmolu.Es domāju, ka jūs jau to uzminējāt.Nelieši man raudāja: “Pirmajā attēlā izmantotais reaģents ir pārāk labs, un pīķis ir viens.Vēlāk, pēc jūsu ieteiktā reaģenta izmantošanas, tas kļūst kā otrajā attēlā, ar jauktām virsotnēm.Tu mani padarīji nožēlojamu."
Atdaliet abus grafikus.No pirmā acu uzmetiena vienam ir viena virsotne, bet otrai ir dubultā virsotne.Muļķības, viena virsotne, protams, ir labi.Vai tā ir taisnība?
Sliktāk par Dou E, ja es ielikšu divas bildes zemāk esošajā bildē, jūs uzreiz sapratīsit.Patiesībā mēs esam viegli paralizēti ar šāda veida attēlu.Pēc rūpīgas analīzes mēs atklājām, ka: pirmās figūras maksimums ir 75°C, kas ir pilnībā grunts dimērs;otrā skaitļa maksimums parādās pie 75°C un 82°C, vismaz ir Produkts parādās.

Studentu atsauksmju attēli
Tātad galvenā problēma nav reaģentu problēma, bet gan gruntskrāsu dizaina problēma.Tajā pašā laikā tas arī pierāda, ka daži lielie zīmoli nav dzelzs kvalitātes, un tas arī pierāda mana brāļa iepriekš teikto: tas nav reaģentu zīmols, kas atbalsta jūsu rakstu.Tas ir jūsu raksts, kas atbalstīja reaģentu zīmolu.Iedomājieties, ja nelieši nemainītu reaģentus, žurnālā tiktu nosūtīti nepareizi dati, un tas, kas notiktu, būtu traģēdija.
2. Tukšas kontroles Ct vērtība
Nepaskaidro, ja tukšajai kontrolei ir Ct vērtība, vai tas nav piesārņojums?Tomēr jums joprojām ir jāsaprot, kurai tukšai vadīklai ir Ct vērtība.Ja tas ir NTC, tas nozīmē, ka ir sveša DNS, piemēram, reaģenta piesārņojums.Ja tas ir NRT, tas nozīmē, ka ekstrahētajā RNS ir DNS piesārņojums.
3. Standarta līkne
Ieskaitot slīpumu un aprēķina formulu, PCR efektivitāti var aprēķināt, izmantojot formulu.Lai veiktu perfektu eksperimentu, standarta līknes slīpumam ir jātuvojas 3,32, bet R² - 0,9999.
4. Lineārais dinamiskais diapazons
Reakcijas dinamiskais diapazons ir lineārs.Saskaņā ar standarta līknes ģenerēšanai izmantoto veidni dinamiskajā diapazonā jāietver vismaz 5 koncentrācijas gradienti un jāpievērš uzmanība Ct vērtību izmaiņām pie augstas koncentrācijas gradientiem un zemas koncentrācijas gradientiem.
5. Noteikšanas precizitāte
Izmaiņas qPCR rezultātos, tas ir, sliktu atkārtojamību, tas ir, sliktu precizitāti, izraisa daudzi faktori, tostarp temperatūra, koncentrācija un darbība.qPCR precizitāte parasti kļūst mazāk kontrolējama, jo kopiju skaits samazinās.Ideālā gadījumā eksperimentālās variācijas ietvaros šai tehniskajai variācijai vajadzētu atšķirties no bioloģiskās variācijas, un bioloģiskie atkārtojumi var tieši risināt qPCR rezultātu statistiskās atšķirības starp grupām vai ārstēšanu.Jo īpaši attiecībā uz diagnostikas pārbaudēm ir jāziņo par labāko starppārbaužu precizitāti (atkārtojamību) starp vietām un operatoriem.
6. Noteikšanas efektivitāte un LOD (multipleksā qPCR)
LOD ir zemākā konstatēto pozitīvo paraugu koncentrācija 95 % apmērā.Citiem vārdiem sakot, mērķa gēnu atkārtojumu komplektā esošā LOD koncentrācija nedrīkst pārsniegt 5% no neveiksmīgajām reakcijām.Veicot multiplekso qPCR analīzi, īpaši vienlaicīgai punktmutāciju vai polimorfismu noteikšanai, multipleksajai qPCR ir jāsniedz pierādījumi tam, ka vairāku mērķa fragmentu precizitāte netiek apdraudēta vienā mēģenē, vairākkārtēja noteikšana un vienas mēģenes noteikšana Efektivitātei un LOD jābūt vienādām.Īpaši tad, ja vienlaikus tiek pastiprināti augstas koncentrācijas mērķa gēni un zemas koncentrācijas mērķa gēni, šai problēmai jāpievērš uzmanība.
Problēmas un risinājumiVispārīgi runājot, qPCR atkļūdošanas laikā bieži sastopamās problēmas ir vērstas uz šādiem aspektiem:
·nespecifiska pastiprināšana
·Grūta grunts koncentrācijas izvēle un problēmas ar grunts-dimēriem
· Atkausēšanas temperatūra ir neprecīza
·Sekundārā struktūra ietekmē pastiprināšanas efektivitāti
nespecifiska pastiprināšana
nespecifiska pastiprināšananotiek , parasti tiek apsvērts, vai gruntskrāsas dizains nav piemērots, bet, ja nesteidzaties ar gruntskrāsu nomaiņu, vispirms varat izmēģināt šādas metodes (princips ir arī pievienots):
·Palieliniet atkausēšanas temperatūru – mēģiniet padarīt vājās ūdeņraža saites nespējīgas uzturēt;
·Saīsināt atlaidināšanas un pagarināšanas laiku – samazināt vājo ūdeņraža saišu iespējamību;
·Samazināt praimeru koncentrāciju – samazināt lieko praimeru un nemērķa reģionu saistīšanās iespēju;
Zema pastiprināšanas efektivitāte
Pretēja situācija nespecifiskajai pastiprināšanai – zema pastiprināšanas efektivitāte, un pasākumi zemas pastiprināšanas efektivitātes novēršanai ir tieši pretēji:
· Pagarināt atlaidināšanas un pagarināšanas laiku;
·Pāriet uz trīspakāpju PCR un samaziniet atkausēšanas temperatūru;
·Palielināt grunts koncentrāciju;
Ps: Daudzi 90. gados dzimuši maģistranti nevēlas mācīties, kā atkļūdot eksperimentus, un cer, ka komplekts var pilnībā atrisināt problēmu (ja vēlaties doties uz reaģentu uzņēmumu, lai veiktu pētniecību un izstrādi pēc absolvēšanas), patiesībā arī reaģentu ražotāji domā šādi, es ceru, ka tas ir muļķīgi. To var izmantot, kad to iegūstat, tāpēc ir iztērēti daudz reaģentu ieviešanas problēmu, tostarp nespecifiski ražotāji. -saišu absorbcijas faktori.Lai viegli atrisinātu problēmu, muļķiem joprojām ir jāizlasa reaģentu uzņēmuma ievads, lai redzētu, vai nav kāds faktors, kas absorbē vājās ūdeņraža saites.
Grūti izvēlēties grunts koncentrāciju un problēmas ar grunts-dimēriem
1. metode: Vispārīgi runājot, qPCR komplekta instrukcijās ir ieteiktās sistēmas un ieteicamās primer koncentrācijas.
2. metode: atkļūdošana, iestatot primer koncentrācijas gradientu.Tālāk redzamais attēls ir nozagts no uzņēmuma, lai ilustrētu.Zemāk esošajā attēlā ir parādīti fluorescences kvantitatīvie rezultāti, kas iegūti, izmantojot trīs primera koncentrācijas gradientus (100 nM, 250 nM, 500 nM) un četrus šablona koncentrācijas gradientus (0,1 ng, 1 ng, 10 ng, 100 ng).Eksperimenta rezultātu Ct vērtība ir attēlota šādi:

Primer koncentrācijas izvēle Savienojiet katru praimera koncentrāciju rindā šādi:

Primera koncentrācijas izvēle ir acīmredzama, lineārā attiecība starp primeru koncentrāciju 100 nM un 250 nM ir labāka, un lineārā attiecība starp primeru koncentrāciju 500 nM ir salīdzinoši slikta.100 nM un 250 nM Ct vērtība 250 nM ir salīdzinoši maza, tāpēc optimālā praimera koncentrācija ir 250 nM.Parasti kušanas līknē var redzēt smagus grunts-dimērus.Ko darīt, ja izstrādātie grunti nevar izvairīties no primer-dimeriem?
3. metode: Samaziniet primeru daudzumu un palieliniet atkausēšanas temperatūru (nav nepieciešams paskaidrot).
Atlaidināšanas temperatūras empīriskā vērtība ir 60°C.Ja neesat pārliecināts, kā izvēlēties piemērotāku atkausēšanas temperatūru?Atbilde ir tāda pati kā gruntskrāsas koncentrācijas izvēle -gradienta tests.Uzņemiet attēlu no uzņēmuma Bio-rad, lai ilustrētu problēmu.Noteikta mērķa fragmenta pastiprināšanai iestatiet astoņus temperatūras gradientus, katrs ar trīs atkārtojumiem, un iegūtā pastiprināšanas līkne ir šāda:

rūdīšanas temperatūras izvēle:
·70°C, 69°C — primerus nevar kombinēt, tāpēc nav pastiprinājuma.
·67,3°C – sākumā ir neliels pastiprinājums, un Ct vērtība ir salīdzinoši liela.
·64,5°C——Ct vērtība samazinās.
· Pie 60,7°C, 58,0°C, 56,2°C un 55,0°C Ct vērtībām būtībā bija tendence būt stabilām, bet galīgās fluorescences vērtības bija atšķirīgas.
Kā izvēlēties?Princips: pirmais princips ir lielāka Ct vērtība.Vienai un tai pašai Ct vērtībai izvēlieties augstāku atkausēšanas temperatūru, lai izvairītos no dimerizācijas un nespecifiskas pastiprināšanas.Lai gan ir augstāka fluorescences vērtība 55 ° C temperatūrā, tajā var būt dimēri vai nespecifiska amplifikācija.
Bet, ja esat tik gudrs kā jūs, jūs noteikti domājat: Loģiski runājot, ja PCR reakcija ir ļoti specifiska, kamēr grunts koncentrācija pārsniedz minimālo prasību, augstajiem un zemākajiem punktiem nevajadzētu būt nekādiem efektiem, tāpat kā fluorescējošām krāsvielām un dNTP.Patiešām, kamēr atlaidināšanas temperatūra ir pareizi optimizēta, primera koncentrācijas ietekme uz Ct vērtību, protams, tiks samazināta līdz minimumam.

Atkausēšanas temperatūra ir pareizi optimizēta, un grunts koncentrācijas ietekme uz CT tiks samazināta līdz minimumam
Sekundārā struktūra ietekmē pastiprināšanas efektivitāti
Paņemsim attēlu no Bio-rad, lai ilustrētu problēmu.Tas arī izstrādā temperatūras gradientu, lai pastiprinātu gēnu ar sekundāro struktūru.

Parādās sekundārā struktūra
Redzams, ka temperatūras gradientam samazinoties, sāk parādīties produkti un Ct vērtība virzās uz priekšu, sasniedzot minimālo vērtību pie 60,7°C, un tad, temperatūras gradientam samazinoties, Ct vērtība kļūst lielāka.Un otrādi, paaugstinoties temperatūrai, sekundārā struktūra atveras un pastiprināšanas efektivitāte palielinās.Pēc noteiktas temperatūras sasniegšanas temperatūras paaugstināšana nevar uzlabot pastiprināšanas efektivitāti.Jo gruntskrāsas šobrīd nevar stabili apvienot.Tāpēcmeklējiet temperatūru ar zemāko Ct vērtību, kas ir labākā temperatūra sekundārās struktūras šablona pastiprināšanai!Protams, gudriem muļķiem ir jāzina, ka, ja tas nav nepieciešams, vislabāk ir mainīt gruntskrāsus un izvairīties no sekundārās struktūras reģiona.
5. Pielietojuma līmenis
MIQE — datu analīze

Datu analīzi galvenokārt nodrošina fluorescējošais kvantitatīvās PCR instruments.Iepriekšējā rakstā tika veikts liels datu analīzes darbs, piemēram, tukšā kontrole, kas tika izskaidrota eksperimenta noformējumā.Ir noskaidroti iekšējie atsauces gēni, atkārtojumu skaitļi utt., šeit mēs galvenokārt izskaidrojam qPCR pielietojumu.
qPCR tiek plaši izmantots, un eksperimentālā pārbaude un nukleīnskābju diagnostika ir visbiežāk izmantotie scenāriji.
absolūtā kvantitatīvā noteikšana
Log (sākotnējā koncentrācija) ir lineāra saistība ar ciklu skaitu.Standarta līkni var novilkt no standarta ar zināmu sākotnējo kopijas numuru, tas ir, var iegūt amplifikācijas reakcijas lineāro attiecību.Pēc parauga Ct vērtības var aprēķināt koncentrāciju paraugā.Iekļauto veidņu daudzums.

Absolūtā kvantitatīvā aprēķina metode
Absolūtā kvantitatīvā noteikšana jābalsta uz standarta līkni.Lai izveidotu standarta līkni, ir nepieciešams standarts.Parasti standarts ir plazmīda, kas iegūta, klonējot mērķa gēnu.Kāpēc tā ir plazmīda?Tā kā cirkulārā plazmīda DNS ir visstabilākā.Atšķaida standarta produktu 5 līdz 6 gradientos atbilstoši dubultošanas attiecībai (10-kārtīgs atšķaidījums) un atšķaidīšanas laikā pievērsiet uzmanību viendabīgumam.Ļaujiet Ct vērtībai nokrist starp 15-30.

Standarta sagatavošana
Tajā pašā laikā pārbaudāmais paraugs ir arī attiecīgi jāatšķaida (atcerieties atšķaidīšanas koeficientu), un arī Ct vērtībai vajadzētu būt no 15 līdz 30.Standarta produkts + pārbaudāmais paraugs tiek likts uz iekārtas kopā.Pēc palaišanas tika izveidota standarta līkne ar standartvielu, un pārbaudāmie paraugi tika ievietoti standarta līknē, lai aprēķinātu koncentrāciju.
B hepatīta vīrusa HBV kvantitatīva noteikšana ir tipiska absolūtā kvantitatīva noteikšana, kas var aprēķināt vīrusa kopiju skaitu 1 ml asiņu.
Eksemplāra numura aprēķins
Pārbaudāmā parauga koncentrācija (ng/ul) = OD260 × 50 ug/ml × atšķaidīšanas koeficients
Parauga molekulmasa = bāzu skaits × 324
Pārbaudāmā parauga kopijas numurs (kopijas/ul) = pārbaudāmā parauga koncentrācija / parauga molekulmasa × 6 × 1014

Kopijas numura aprēķināšanas metode

Iepriekš minētā ir aprēķina metode daudzuma noteikšanai.Šī ir matemātiska problēma, ko var atrisināt pēc pamatskolas beigšanas, un matemātiskās problēmas parasti risina datori.Ja nesaproti, vari nākt komunicēt.
relatīvā kvantitatīvā noteikšana
Relatīvo kvantitatīvo noteikšanu galvenokārt izmanto zinātniskajos pētījumos.Cik vīrusu ir 1 ml asiņu, un tas ir DNS vīruss, tas ir samērā deterministisks notikums: var noteikt asiņu daudzumu, un DNS vīruss ir salīdzinoši stabils.Tomēr mums ir grūti salīdzināt noteikta gēna transkripcijas kopiju skaitu lapā, jo ir grūti noteikt lapas izmēru, svaru un maigumu, grūti noteikt ekstrahētās RNS daudzumu, kā arī ir grūti noteikt reversās transkripcijas efektivitāti, proti, jebkurš solis var izraisīt eksperimentālos datos kļūdas un tos nevar izmantot.
Tāpēc relatīvajā kvantitatīvā noteikšanā jāievieš elements:iekšējais atsauces gēns.
Citiem vārdiem sakot, relatīvā kvantitatīva noteikšana faktiski ir mērķa gēnu un iekšējo atsauces gēnu salīdzinājums.Salīdzinot ar tiem pašiem audiem un tajā pašā šūnā, parauga lieluma, RNS ekstrakcijas daudzuma, reversās transkripcijas efektivitātes un PCR efektivitātes ietekme ir salīdzinoši neliela.Mazā parauga lieluma dēļ gan iekšējie atsauces gēni, gan mērķa gēni bija salīdzinoši samazināti.Tāpēc mēs jau iepriekš esam uzsvēruši vienveidību un stabilitāti.
Iekšējie atsauces gēni parasti irmājturības gēni(mājas uzturēšanas gēni), kas attiecas uz gēnu klasi, kas ir stabili ekspresēta visās šūnās, un to produkti ir nepieciešami, lai uzturētu šūnu pamata dzīves aktivitātes.
Nejauciet šo jēdzienu.Mājturības gēni ir bioloģisko funkciju termini, savukārt iekšējie atsauces gēni ir eksperimentāli tehniski termini.Mājturības gēniem ir jāiziet validācija, pirms tos var atlasīt kā iekšējos atsauces gēnus.
Piemēram, mēs atlasījām vairākus mājturības gēnus zemāk esošajā attēlā, lai pārbaudītu to ekspresijas līmeņus dažādās audu šūnās, un atklājām, ka β-2-mikroglobulīna ekspresijas līmeņi bija diezgan atšķirīgi no pārējo trīs gēnu ekspresijas līmeņiem, tāpēc tos nevarēja izmantot kā iekšējos atsauces gēnus.

Pēc iekšējā atsauces gēna korekcijas funkcijas izpratnes iekšējā atsauces gēna ieviešanas dēļ tiek iegūti divi algoritmi.
·dubultā standarta līknes metode
·2 – △△Ct metode (CT vērtību salīdzināšanas metode)
Ja jūs interesē sugu un gēnu funkciju izpēte, lūdzu, atsakieties no algoritmu izpētes un izmantojiet formulas tieši vai tieši izmantojiet mašīnas;ja esat tīrs puisis matemātikā un inženierzinātnēs, lūdzu, jūtieties brīvi.
dubultstandarta līknes metode
Kvantitatīvi nosakiet kontroles parauga un pārbaudāmā parauga mērķa gēnu un mājturības gēnu, izmantojot standarta līkni, un pēc tam aprēķiniet relatīvo vērtību saskaņā ar aprēķina formulu, kas ir relatīvais ekspresijas līmenis.
Priekšrocības: vienkārša analīze, salīdzinoši vienkārša eksperimentālā optimizācija
Trūkums: katram gēnam katrai eksperimentu kārtai ir jāizveido standarta līkne
Pielietojums: Viena no divām visbiežāk izmantotajām un atzītajām relatīvajām kvantitatīvajām metodēm gēnu ekspresijas regulēšanas pētījumos
Formula ir šāda:

Piemēri ir šādi:

Aprēķiniet relatīvo daudzumu, pamatojoties uz kvantitatīvo rezultātu
2 – △△Ct metode (CT vērtību salīdzināšanas metode)

Priekšrocības: nav jāveido standarta līkne
Trūkumi: tiek pieņemts, ka pastiprināšanas efektivitāte ir tuvu 100%;standarta novirze ir < 5 %, un tiek pieņemts, ka standarta līkne un efektivitāte starp katru pastiprinājumu ir konsekventa;eksperimentālo apstākļu optimizācija ir sarežģītāka.
Pielietojums: Viena no divām visbiežāk izmantotajām un atzītajām relatīvajām kvantitatīvajām metodēm gēnu ekspresijas regulēšanas pētījumos

Protams, amplifikācijas efektivitāte parasti nevar būt ideāli 1. Korekcijas metode: Ja mēs zinām, ka mērķa gēnam un atsauces gēnam ir vienāda amplifikācijas efektivitāte, bet amplifikācijas efektivitāte nav vienāda ar 1, tad 2－△△Ct var koriģēt šādi: (1+E )－△△, ja lietderības koeficients ir aprēķins Ct, piemēram, 0.9.9. 1,95 －△△ Ct
Līdz šim saturs par fluorescējošu kvantitatīvo PCR ir beidzies.