Escherichia Coli O157: H7 nukleīnskābes noteikšanas komplekts (PCR fluorescējošās zondes metode/liofilizācija)
Komplekta apraksts:
Kaķa Nr.FP103
To izmanto ātrai E. coli O157:H7 noteikšanai un skrīningam pārtikas, barības, ūdens paraugos un vides paraugos.
Apraksti
To lieto, laiātra E. coli O157:H7 noteikšana un skrīnings pārtikas, barības, ūdens paraugos un vides paraugos.
[Pārbaudes princips]
Saskaņā ar fluorescējošās PCR tehnoloģijas principu specifiskam Escherichia coli O157: H7 gēnam ir izstrādāti specifiski praimeri un Taqman zondes, kas tiek noteiktas ar fluorescējošu PCR instrumentu, lai realizētu Escherichia coli O157: H7 noteikšanu Kvalitatīva DNS noteikšana.
Komplekta saturs
Piezīme: ROX kanāla zonde nav iekļauta.
| Coponenti | Specifikācija | Qvienība |
| Buferis A | Caurule | 1 |
| Buferis B | Caurule | 1 |
| Pozitīva kontrole | Caurule | 1 |
| Negatīvā kontrole | Caurule | 1 |
Paredzamais lietojums
To lieto, lai ātra E. coli O157:H7 noteikšana un skrīnings pārtikas, barības, ūdens paraugos un vides paraugos.
Uzglabāšanas nosacījumi un derīguma termiņš
Uzglabāt -20 ℃ tumsā un izvairīties no atkārtotas sasaldēšanas un atkausēšanas.
Derīguma termiņš ir 12mēnešus, un ražošanas datums ir norādīts uz ārējā iepakojuma.
Instrumenti un palīgmateriāli
Fluorescējošais kvantitatīvais PCR instruments, pipetes pistole un atbilstošie uzgaļi, virpuļkratītājs, mini centrifūga.
Lietošana
1. Paraugu apstrāde
1.1. Parauga veids: Šis komplekts ir piemērots pārtikas, barības, ūdens paraugiem un citiem paraugiem, par kuriem ir aizdomas, ka tie ir inficēti ar Escherichia coli O157:H7.Dziļi apstrādātiem gaļas produktiem, dzērieniem un citām pigmentus saturošām vielām tie ir jāizskalo, lai neietekmētu fluorescences signālu savākšanu.
1.2. Paraugu apstrāde: skatiet "GB 4789.10-2016 Pārtikas drošības valsts standarts Escherichia coli O157 pārtikas mikrobioloģiskā izmeklēšana: H7 tests" par paraugu sagatavošanu, bagātināšanas kultūru un Escherichia coli O157: H7 izolāciju.
- Nukleīnskābes ekstrakcija
Paņemiet 20 ml bagātināšanas šķīduma 1,5 ml centrifūgas mēģenē, pievienojiet 200 μL mikrobu lizāta (nepieciešams papildu komplekts), maisiet 30 sekundes, īsi centrifugējiet un novietojiet malā.
Piezīmes: Nukleīnskābes ekstrakcija no lizāta jāpabeidz 10 minūšu laikā, un to nevar uzglabāt ilgu laiku.
3. Nukleīnskābju pastiprināšana
3.1. Lai izmantotu, ieslēdziet fluorescējošu kvantitatīvo PCR instrumentu.
Buferi A un Buferi B no komplekta, rūpīgi izkausējiet tos un īsi centrifugējiet.Katrai PCR reakcijas mēģenei pievienojiet 18 μL buferšķīduma A un 2 μL buferšķīduma B.Pēc tam PCR reakcijas mēģenēs pievienojiet 5 ml negatīvās kontroles, ekstrahētās nukleīnskābes un pozitīvās kontroles, aizveriet mēģenes un īsi centrifugējiet.
3.3. Pārnesiet PCR reakcijas cauruli uz fluorescējošu PCR iekārtu un izmantojiet šādas procedūras, lai veiktu amplifikācijas eksperimentus: izvēlieties 25 ml reakcijas sistēmai, savāciet fluorescences signālus 60°C temperatūrā katram ciklam un atlasiet FAM noteikšanas kanālam.
| Solis | Programma | Ciklu skaits |
| 1 | 37℃ 5 min | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3 min | 1 |
| 3 | 95°C 15s | 4 0 |
| 60℃ 30s (savāc fluorescenci) |
Rokasgrāmatas problēmu analīzei
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
RNS nevar ekstrahēt vai nukleīnskābes iznākums ir zems
Parasti ir daudzi faktori, kas ietekmē reģenerācijas efektivitāti, piemēram: parauga RNS saturs, darbības metode, eluēšanas tilpums utt.
Bieži sastopamo cēloņu analīze:
1. Ledus vanna vai zemas temperatūras (4 °C) centrifugēšana darbības laikā.
Ieteikums: Darbība istabas temperatūrā (15-25 °C), nekad ledus vannā un zemas temperatūras centrifūgā.
2. Nepareiza paraugu uzglabāšana vai pārāk ilga paraugu uzglabāšana.
Ieteikums: Uzglabājiet paraugus -80 ° C temperatūrā vai sasaldējiet šķidrā slāpeklī un izvairieties no atkārtotas sasaldēšanas-atkausēšanas;mēģiniet RNS ekstrakcijai izmantot tikko savāktos paraugus.
3.Nepietiekama parauga līze
Ieteikums: lūdzu, pārliecinieties, ka paraugs un darba šķīdums (Lineārais akrilamīds) ir rūpīgi sajaukti un inkubēti 10 minūtes istabas temperatūrā (15-25 °C).
4.Eluents tika pievienots nepareizi
Ieteikums: pārliecinieties, ka attīrīšanas kolonnas membrānas vidū ir pievienots RNase-Free ddH2O.
5. Nepareizs bezūdens etanola daudzums buferšķīdumā viRW2
Ieteikums: lūdzu, izpildiet norādījumus, pievienojiet pareizo daudzumu bezūdens etanola buferšķīdumam viRW2 un kārtīgi samaisiet pirms komplekta lietošanas.
6. Nepareiza parauga izmantošana.
Ieteikums: 200 µl parauga uz 500 µl bufera viRL.Pārmērīga parauga tilpuma dēļ samazināsies RNS ekstrakcijas ātrums.
7.Nepareizs eluēšanas tilpums vai nepilnīga eluēšana.
Ieteikums: Attīrīšanas kolonnas eluenta tilpums ir 30-50μl;ja eluēšanas efekts nav apmierinošs, ieteicams pievienot iepriekš uzkarsētu RNase-Free ddH2O un pagariniet laiku, novietojot istabas temperatūrā, piemēram, 5-10 min
8. Attīrīšanas kolonnā ir etanola atlikumi pēc skalošanas buferšķīdumā viRW2.
Ieteikums: Ja pēc skalošanas buferšķīdumā viRW2 un tukšas mēģenes centrifugēšanas 2 minūtes joprojām paliek etanols, attīrīšanas kolonnu pēc centrifugēšanas tukšā mēģenē var atstāt istabas temperatūrā 5 minūtes, lai pilnībā noņemtu atlikušo etanolu.
Attīrītu RNS molekulu degradācija
Attīrītās RNS kvalitāte ir saistīta ar tādiem faktoriem kā paraugu uzglabāšana, RNāzes piesārņojums un darbība.
Bieži sastopamo cēloņu analīze:
1.Ievāktie paraugi netika savlaicīgi saglabāti.
Ieteikums: Ja paraugs netiek izmantots laikā pēc savākšanas, lūdzu, nekavējoties uzglabājiet to -80 ℃ vai šķidrā slāpeklī.RNS molekulu ekstrakcijai, kad vien iespējams, mēģiniet izmantot tikko savāktus paraugus.
2. Savāktie paraugi tika atkārtoti sasaldēti un atkausēti.
Ieteikums: Izvairieties no atkārtotas sasaldēšanas un atkausēšanas (ne vairāk kā vienu reizi) paraugu savākšanas un uzglabāšanas laikā, pretējā gadījumā samazināsies nukleīnskābes iznākums.
3. Operāciju zālē tika ieviesta RNāze vai netika valkāti vienreizējie cimdi, maskas utt.
Ieteikums: RNS molekulu ekstrakcijas eksperimentu vislabāk veikt atsevišķā RNS operāciju telpā, un eksperimentālo galdu pirms eksperimenta notīra.Eksperimenta laikā valkājiet vienreizējās lietošanas cimdus un maskas, lai izvairītos no RNS degradācijas, ko izraisa RNāzes ievadīšana.
4. Lietošanas laikā reaģents ir piesārņots ar RNāzi.
Ieteikums: nomainiet ar jaunu vīrusu RNS izolācijas komplektu saistītiem eksperimentiem.
5. RNāzes piesārņojums centrifūgas caurulēs, pipešu uzgaļos utt. Ieteikums: Pārliecinieties, vai centrifūgas mēģenes, pipetes uzgaļi un pipetes nesatur RNāzes.
Attīrītās RNS molekulas ietekmēja pakārtotos eksperimentus
RNS molekulas, kas attīrītas ar attīrīšanas kolonnu, ietekmēs pakārtotos eksperimentus, ja ir pārāk daudz sāls jonu vai proteīnu, piemēram: reversā transkripcija, Northern Blot utt.
1.Eluētajās RNS molekulās ir atlikušie sāls joni.
Ieteikums: Pārliecinieties, vai buferšķīdumam viRW2 ir pievienots pareizais bezūdens etanola daudzums, un divreiz mazgājiet attīrīšanas kolonnu atbilstoši pareizajam centrifugēšanas ātrumam, kas norādīts lietošanas instrukcijā. Ja vēl ir atlikuši sāls joni, varat pievienot attīrīšanas kolonnai Buffer viRW2 un atstāt to istabas temperatūrā 5 minūtes.Pēc tam veiciet centrifugēšanu, lai maksimāli noņemtu sāls jonu piesārņojumu
2. Eluētajās RNS molekulās ir atlikušais etanols
Ieteikums: kad esat pārliecināts, ka attīrīšanas kolonnas ir izskalotas ar buferšķīdumu viRW2, veiciet centrifugēšanu tukšā caurulē atbilstoši centrbēdzes ātrumam, kas norādīts lietošanas instrukcijā.Ja vēl ir palicis etanols, pēc centrifugēšanas tukšā mēģenē to var atstāt uz 5 minūtēm istabas temperatūrā, lai maksimāli noņemtu atlikušo etanolu.
Lietošanas rokasgrāmatas:
Vīrusu RNS izolācijas komplekta lietošanas instrukcija
